ANÁLISIS DE SUSTANCIAS MEDIANTE FOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN

.En el LAC se realiza la determinación en la muestra biológica de:-Presencia / ausencia del analito.-Concentración del analito.-Actividad de numerosas enzimas.-.-.-.Para ello se adicionan a la muestra biológica los reactivos comerciales que originan cambios que pueden ser cuantificados por los equipos instrumentales..Podemos clasificar los métodos analíticos espectroscópicos en: SEGÚN EL TIPO DE MEDIDA y SEGÚN EL TIPO DE REACTIVO EMPLEADO. 1. SEGÚN EL TIPO DE MEDIDA:1.1 Métodos a punto final:En estos métodos se incuba una solución que contiene la muestra y los reactivos durante el tiempo necesario para que se COMPLETE LA REACCIÓN O SE ALCANCE EL EQUILIBRIO y en condiciones de temperatura, pH… predeterminadas. A+B+C->D+E A = muestra conteniendo el analito B, C = reactivos comerciales D, E = productos.-.-.-.La concentración del analito es DIRECTAMENTE PROPORCIONAL a la concentración del producto/s formados o de forma indirecta, por aparición o desaparición de una sustancia medible debido a la existencia del analito en la muestra. En este momento se miden la absorbancias de la solución patrón y de la muestra problema a la longitud de onda adecuada. Los cálculos a realizar son:1.1.1. Método a punto final ajustando el espectrofotómetro con el blanco..El protocolo del kit comercial establece las condiciones (temperatura, dilución de la muestra, factores…) que deben seguirse para que se cumpla la Ley de Lambert-Beer y que el método se encuentre dentro del límite de linealidad.-.-.Para realizar la determinación de la concentración del analito en la muestra problema se utiliza una solución patrón de concentración conocida y aplic-amos la Ley de Lambert-Beer a la solución patrón y a la muestra problema: Apa=a*b*Cpa — Apr=a*b*Cpr.-.-.-En ambas ecuaciones el valor de a/e (coeficiente de absorción/coeficiente de absorción molar) y de b (trayecto óptico), es el mismo, por lo tanto si se dividen tenemos:Apa/Apr=Cpa/Cpr — Cpr=(Apr/Apa) *Cpa.Si se conoce a (absortividad o coeficiente de absorción) o e(Epsilón o coeficiente de absorción molar), no hace falta utilizar patrón, basta aplicar la Ley de Lambert-Beer: A=e*b*c — C=A/e*b .-.-.-Para realizar una determinación más exacta se puede utilizar una CURVA DE CALIBRACIÓN con soluciones de concentración conocida extrapolando los valores de concentración del analito a partir de la medida de absorbancia de la solución problema.1.1.2. Método a punto final con medida del blanco.Se miden la absorbancia del patrón, de la muestra problema y del blanco y utilizamos la siguiente fórmula: Cpr= (Apr-Abl /Apa-Abl ) Cpa.1.2. Métodos a dos puntos:Es un método útil para evitar interferencias, se realizan dos valores de absorbancia en dos momentos distintos del proceso. Así tenemos: Cpr= (A₂-A₁)problema / (A₂-A₁)patron *Cpa.1.3. Métodos cinéticos:En los métodos cinéticos se determina la VARIACIÓN DE LA ABSORBANCIA EN EL TIEMPO.-.-.-La medida de las absorbancias se realizan antes de que concluya la reacción y los resultados obtenidos son proporcionales a la concentración del analito o a la actividad enzimática si el analito es un enzima.-.-.La variación en los valores de las absorbancias son debidas a: -Aparición/desaparición de sustancias capaces de absorber la longitud de onda óptima utilizada debido a la existencia del analito.-Variaciones en la concentración del propio analito.-.-.-.Estos métodos pueden ser enzimáticos o no enzimáticos, según se utilicen o no enzimas como reactivos. Es muy importante mantener las condiciones en que debe transcurrir la reacción, las cuales están indicadas en el prospecto, para obtener resultados fiables.-.-.-.La variación de la absorbancia es directamente proporcional a la concentración del analito y si el analito es un enzima, a su actividad enzimática.-.-.-.La variación de la absorbancia, extinción o densidad óptica en la unidad de tiempo se expresa como incremento (D) de la absorbancia, de la extinción o de la densidad óptica. DA=DE=DDO.-.-.-.Generalmente la unidad de tiempo utilizada en este caso es el minuto, por tanto tenemos: DDo/min.-.-.-.Para cuantificar la concentración o la actividad enzimática del analito debemos determinar en primer lugar la variación de la absorbancia (.DO/min) para posteriormente, aplicar cualquiera de las fórmulas derivadas de la Ley de Lambert-Beer.Determinación de la variación de la absorbancia:Debe realizarse durante LA FASE LINEAL DE LA REACCIÓN donde la velocidad de formación del producto es constante. Así pues, tras el período de incubación se realiza la medición de las absorbancias a intervalos de un minuto: Absorbancia Tiempo Valor 1ª A1 0´ 2ª A2 1´ 3ª A3 2´ 4ª A4 3´ A D’DO Valor –.DO1 A1- A2 V1 –.DO2 A2- A3 V2–.DO3 A3- A4 V3 –. DO promedio = V1+ V2+ V3 / 3 .–.Siendo el resultado un valor absoluto.1.3.1. Determinación de concentración del analito mediante variaciones de la absorbancia:A. Modificación de la Ley de Lambert-Beer D’DO/min=e*b*C — C=(D’DO/min) /e*b =D’DO/minxF.Siendo F un factor que puede ser aportado por el fabricante del kit y que corresponde a 1 dividido por el producto de . y b que son valores constantes y conocidos.B. Método cinético mediante la utilización de un patrón:Cpr=(D’DOpr/D’DOpa )x Cpa .C. Método cinético con medida de blanco:Cpr=(D’DOpr -D’DObl /D’DOpa – DObl)x Cpa.1.3.2. Determinación de ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (AE). Podemos emplear varios métodos:-Mediante la aplicación de la Ley de Lambert-Beer.-Mediante una curva de calibración.-Con medidas indirectas de la concentración del sustrato .2. SEGÚN EL TIPO DE REACTIVO EMPLEADO . 2.1. Métodos colorimétricos Se denominan así a las reacciones analíticas que se miden empleando longitudes de onda dentro del visible. También se pueden llamar así haciendo referencia a un tipo de reactivos, los cromógenos, sustancias coloreadas o capaces de formar compuestos coloreados y que por tanto, absorben en el visible. Estos compuestos pueden: .Unirse al parámetro y formar un compuesto coloreado.-Aparecer en el medio como consecuencia de la existencia del analito.-Desaparecer a causa de la presencia del analito..-.-.-.-.En cualquier caso, la intensidad del color o su variación, es directamente proporcional a la concentración del parámetro a determinar. Para determinar la concentración se pueden emplear patrones y la siguiente expresión: Cpr=Apr/As *Cs.-.-Generalmente son reacciones a punto final, pero también pueden ser colorimétricas y cinéticas por lo que se emplearía la expresión siguiente:D’DO/=C*F.2.2. Métodos enzimáticos:Son aquellos métodos analíticos en las que alguno(s) de los reactivo(s) son enzimas. No tienen porqué ser métodos donde lo que se mida sean actividades enzimáticas. El enzima, añadido como parte de los reactivos, al unirse al parámetro desencadena una reacción que permite su determinación bien por aparición de un compuesto coloreado (métodos a punto final), bien por variación de la absorbancia por unidad de tiempo (métodos enzimáticos).

 UD. 2: METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO. 1. INTRODUCCIÓN. METABOLISMO. La bioquímica es la parte de la química que se encarga de estudiar la base molecular de la vida y comprende tanto el estudio de todas las sustancias que existen en los sistemas vivos como las reacciones que presentan para entender mejor a los seres vivos. En los procesos vitales interaccionan un gran número de substancias de alto peso molecular (macromoléculas), con compuestos de menor tamaño, dando por resultado un número muy grande de reacciones coordinadas que producen: . la energía que necesita la célula para vivir, . la síntesis de todos los componentes de los organismos vivos y . la reproducción celular. .-.-Existen cinco grupos principales de compuestos bioquímicos:- Los carbohidratos son un grupo de compuestos que incluyen la glucosa, el glucógeno, el almidón y la celulosa. La unidad fundamental que se encuentra en los carbohidratos es el monosacárido.- Los lípidos son un grupo de compuestos que incluyen las grasas y aceites. Son compuestos bioquímicos solubles en compuestos no polares tales como el tetracloruro de carbono, CCl4, el éter dietílico (CH3CH2)2O y el benceno, C6H6.- Las proteínas son un grupo de compuestos constituidos por polímeros de aminoácidos.- Los ácidos nucléicos son un grupo de compuestos polímeros de los nucleótidos. Un nucleótido es una molécula que se hidroliza a una amina heterocíclica, un azúcar simple y un grupo fosfato.-Las sustancias bioinorgánicas incluyen todos los elementos y compuestos inorgánicos que existen en los seres vivos. .-.–De la observación del medio que nos rodea se desprende que los organismos vivos no están en equilibrio estático con el medio,(omeostasis: equilibrio interno que mantiene el orden del organismo)pues requieren un aporte continuo de energía libre que mantenga orden en un universo que tiende al máximo desorden.Podemos entender el metabolismo como aquel proceso general por el cual los sistemas vivos adquieren y utilizan la energía libre que necesitan para realizar las diversas funciones que ocurren dentro e ellos. También como todas aquellas transformaciones que sufren los productos que recibe el organismo del exterior, desde su ingreso hasta que son eliminados. Y todo esto lo consiguen acoplando las reacciones exoergónicas de la oxidación de los nutrientes a los procesos endoergónicos requeridos para mantener los sistemas vivos. Etimológicamente el origen de la palabra metabolismo procede del griego metabolé (µetaß…sµ..) que significa cambio, transformación. El metabolismo consiste literalmente en cientos de reacciones enzimáticas organizadas en rutas características. Estas rutas se desarrollan paso a paso transformando los substratos sobre los que se actúa en productos finales a través de la formación de innumerables intermediarios. Debido a este motivo, el metabolismo se denomina metabolismo intermediario.Los mapas metabólicos representan virtualmente todas las reacciones más importantes del metabolismo intermediario que tienen lugar en un organismo, tanto de los carbohidratos, lípidos, aminoácidos, nucleótidos y todos sus derivados. Cada una de las sustancias que se producen en este conjunto de reacciones metabólicas se denomina metabolito. El conjunto de reacciones que suceden en forma secuencial y que dan lugar a un compuesto o a una función integran un camino metabólico y se le da un nombre específico. Por ejemplo, 1) la glicólisis, es el camino metabólico por medio del cual se oxidan los azúcares produciendo piruvato y equivalentes reducidos NADH; 2) la transformación de la acetil-coenzima A, proveniente de la descarboxilación del piruvato o de la beta-oxidación de los ácidos grasos, en dióxido de carbono y nucleótidos reducidos (NADH, NADPH, FADH2) se le denomina ciclo de Krebs; 3) Los protones y electrones de los nucleótidos reducidos se ceden al oxígeno para formar agua, para la producción de ATP o fines biosintéticos. Estas reacciones se le denominan cadena de transporte de electrones o fosforilación oxidativa (conjunto de enzimas complejas que catalizan varias reacciones de óxido-reducción, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones). 2 H⁺ + 2 e- + ½ O2 -> H2O — ADP +Pi -> ATP + H2O

.En el metabolismo podemos considerar pues dos vertientes: catabolismo (destruccion) y anabolismo(formacion):El catabolismo comprende los procesos degradativos del metabolismo en los cuales, moléculas complejas (glúcidos, lípidos y proteínas) cuyo origen puede ser exógeno -alimentos- o endógeno -reservas- son degradadas para obtener moléculas más sencillas como ácido láctico, ácido acético, urea, amoníaco, ácido úrico, liberando energía que es almacenada en forma de ATP. El anabolismo constituye la fase biosintética del metabolismo en la cuál se realiza la síntesis y renovación de los componentes moleculares de la célula -ácidos nucleícos, proteínas, lípidos y polisacáridos- a partir de sus precursores más sencillos, siendo la energía necesaria para ello aportada por el ATP generado en los procesos catabólicos. .-.-.- Ambos procesos metabólicos, catabolismo y anabolismo, no se dan por separado ya que cada célula se halla en un proceso constante de destrucción y regeneración utilizando la energía y los productos procedentes de las vías catabólicas para procesos biosintéticos..-.- Las enzimas y hormonas son los elementos encargados de regular los procesos metabólicos. .–Los principios inmediatos son las sustancias que el organismo recibe desde el exterior o aquellas que van a ser transformadas en las reacciones metabólicas- hidratos de carbono, lípidos y proteínas-.Las funciones específicas del metabolismo son cuatro: OBTENCIÓN DE ENERGÍA. Conversión de los principios nutritivos exógenos en PRECURSORES de las macromoléculas que formarán estructuras celulares. Ensamblaje de los precursores para FORMAR proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y otros componentes celulares. FORMACIÓN Y DEGRADACIÓN de biomoléculas necesarias para la realización de las funciones celulares.2. HIDRATOS DE CARBONO. 2.1. CONCEPTO CLASIFICACION. Los Hidratos de Carbono o Glúcidos son biomoléculas orgánicas constituidas básicamente por C, H, y O (excepcionalmente contienen N, S, o P), en la proporción que indica su fórmula empírica Cn(H2O)n, por eso se les llamó Carbohidratos o Hidratos de Carbono, ya que los primeros químicos, observaron en sus investigaciones que al calentar azúcares por un período prologado de tiempo, en un tubo de ensayo abierto, obtenían un residuo negro, carbón y gotas de agua condensadas en las paredes del tubo lo que les hizo pensar que estaban formados por una estructura carbonada hidratada con moléculas de agua; hoy en día se sabe que no es así aunque su fórmula empírica lo pueda sugerir.CLASIFICACIÓN:MONOSACÁRIDOS :Glúcidos de 3 a 7 átomos de C., con propiedades reductoras.OLIGOSACARIDOS:De 2 a 10 monosacáridos. Resultan de especial interés disacáridos y trisacáridos POLISACÁRIDOS:Mas de 10 monosacáridos 2.2. MONOSACÁRIDOS:Son los glúcidos más sencillos. No son hidrolizables; esto es, no se pueden descomponer por hidrólisis en otros glúcidos más simples y constituyen los monómeros a partir de los cuales se forman los demás glúcidos. Químicamente son polihidroxialdehídos, polihidroxicetonas o sus derivados. Un polihidroxialdehído es un compuesto orgánico formado por un esqueleto carbonado que tiene una función aldehído en el primer carbono y en los restantes carbonos una función alcohol. Las polihidroxicetonas en lugar de una función aldehído tienen una función cetona, normalmente en el carbono 2. Los monosacáridos que tienen función aldehído se llaman aldosas y cetosas los que tienen una función cetona. Los monosacáridos responden a la fórmula empírica Cn(H2O)n. El valor de n normalmente está comprendido entre 3 y 7. Los monosacáridos son sólidos, cristalinos, incoloros o blancos, de sabor dulce. Como los grupos hidroxilo son polares, los monosacáridos son muy solubles en agua, pues se establecen enlaces polares con las moléculas de agua. Todos los monosacáridos tienen carácter reductor a causa de los grupos aldehído o cetona (grupo carbonilo) que se pueden oxidar y formar grupos carboxilo (-COOH). Así, reducen fácilmente los compuestos de cobre y de plata oxidándose y permitiendo reconocer su presencia, pues la reducción de las sales cúpricas del licor de Fehling a cuprosas hace virar el reactivo del azul al rojo ladrillo. Estos compuestos pueden quemarse u oxidarse a dióxido de carbono (CO2) y agua (H2O), en una reacción que produce energía, capacidad que ha sido aprovechada por muchos seres vivos que degradan la glucosa, y aprovechan la energía desprendida almacenándola en forma de ATP (adenosín trifosfato). Los monosacáridos se clasifican según la naturaleza química de su grupo carbonilo y del número de átomos de carbono que poseen. Atendiendo a la naturaleza química del grupo funcional carbonílico,–si éste es aldehído el monosacárido recibe el nombre genérico de aldosa, y –si es cetónico el monosacárido se le designa como cetosa.-.-.-. Dependiendo del número de átomos de carbono de la molécula, los monosacáridos se denominan triosas, tetrosas, pentosas, hexosas Cuando contienen tres, cuatro, cinco, seis, etc. átomos de carbono. Se conocen en la naturaleza monosacáridos de hasta 8 átomos de carbono. El gliceraldehido es la aldosa más simple. Está formado por tres átomos de carbono, el primero contiene el grupo aldehído, el segundo tiene unido un hidrógeno y un grupo hidroxilo, mientras que el tercero posee dos hidrógenos y un hidroxilo. De los tres carbonos, el segundo (C-2) posee los cuatro sustituyentes distintos y por esta característica, este carbono 2, recibe el nombre de carbono asimétrico o quiral. Este hecho hace que el gliceraldehido exista en dos estructuras espaciales que se diferencian por cierta propiedad física (actividad óptica): una tiene el hidroxilo del C-2 hacia la derecha (D-gliceraldehido) y la otra posee el hidroxilo del C-2 hacia la izquierda (L-gliceradehido). -.-.-. Las moléculas que aún teniendo la misma fórmula molecular tienen diferentes propiedades se denominan isómeros. A los isómeros que se diferencian por la disposición espacial de los grupos sustituyentes de un centro quiral se les conoce con el nombre de isómeros ópticos. Dichos isómeros ópticos presentan una propiedad física denominada actividad óptica. La actividad óptica es la capacidad que tienen las moléculas quirales, en disolución, de desviar el plano de un haz de luz polarizada. Si lo hacen a la derecha en el sentido de las manecillas del reloj son dextrógiros (+), si lo hacen en sentido contrario hacia la izquierda levógiros (-). Esta cualidad es independiente de su pertenencia a la serie D o L y, obviamente, la desviación se debe a la ausencia de planos de simetría de la molécula.REPRESENTACION DE LOS MONOSACÁRIDOS:Fórmula lineal:La forma más frecuente de representar a los monosacáridos es mediante las proyecciones de Fischer, en la que los enlaces simples forman ángulos de 90º, el grupo funcional principal se situa en la parte superior y los grupos hidroxilos a la derecha oizquierda (esteroisómeros D o L respectivamente).Fórmulas de proyección (proyecciones de Haworth):Las aldopentosas y las hexosas en disolución no presentan una estructural lineal, sino que adoptan estructuras cíclicas de forma pentagonal o hexagonal con los radicales de cada carbono en la parte superior o inferior del plano. Los grupos aldehídos o cetonas pueden reaccionar con un hidroxilo de la misma molécula convirtiéndola en anillo. La formación del ciclo se realiza mediante un enlace hemiacetal que representa un enlace covalente entre el grupo aldehído y un alcohol (en el caso de las aldosas) o un enlace hemicetal si se produce entre el grupo cetona y un alcohol (caso de las cetosas). Este enlace no implica una ganancia o pérdida de átomos sino su reorganización.-.-.-.-. El anillo puede ser pentagonal o furanósico (por su semejanza al furano), o hexagonal o piranósico (por su semejanza al pirano). Una fructosa ciclada será una fructofuranosa y una glucopiranosa será el caso de la glucosa. Las formas cíclicas pueden ser representadas dándole un sentido tridimensional de acuerdo con la formulación de Haworth. Un aspecto importante del proceso es que al formarse el correspondiente hemiacetal, el C-1 de la glucosa (que inicialmente era no quiral) se transforma en un carbono quiral (con 4 sustituyentes distintos). Este nuevo carbono quiral recibe el nombre de anomérico, y da lugar a dos estructuras denominadas anómeros, uno con el grupo hidroxilo del C-1 por debajo del anillo, anómero a, y el otro con el grupo hidroxilo por encima del anillo, anómero ß. Así, por ciclación de la D-glucosa obtenemos los hemiacetales a-D-glucopiranosa y la ß-D-glucopiranosa. De la misma manera la D-fructosa se cicla por reacción del hidroxilo del carbono 5, con el carbonilo que ocupa la posición 2, dando lugar, en este caso, a un anillo de furanosa (por similitud con el anillo de furano), con dos anómeros; uno sería la a-D-fructofuranosa y el otro la ß-D-fructofuranosa. En general, las hexosas y las pentosas pueden adoptar la forma de pirano o furano dependiendo de la naturaleza del azúcar. Es importante indicar que en disolución acuosa existe un equilibrio entre la forma abierta y los anillos ciclados. De tal manera que la D-glucosa se presentaría en equilibrio entre su anómerosa y ß. Entre los monosacáridos más importantes tenemos: . Pentosas: La D-ribosa forma parte del ácido ribonucleico y la 2 desoxirribosa del desoxirribonucleico. . Hexosas: La D-Glucosa se encuentra libre en los seres vivos. Es el mas extendido en la naturaleza, utilizándolo las células como fuente de energía. La D-fructosa se encuentra en los frutos y la D-Galactosa en la leche.2.3. OLIGOSACARIDOS. DISACÁRIDOS Los oligosacáridos son cadenas cortas formadas por la unión de 2 a 10 monosacáridos. Los más importantes y abundantes son los disacáridos que contienen dos monosacáridos unidos mediante un enlace O-glucosidico. El enlace O-glucosídico se forma entre grupo -OH del carbono anomérico del primer monosacárido y cualquier -OH del segundo monosacárido, incluyendo el anomérico, con eliminación de una molécula de agua. Será a-Glucosídico si el primer monosacárido es a (posición del -OH en el carbono anomérico hacia abajo), y ß-Glucosídico si el primer monosacárido es ß (posición del -OH en el carbono anomérico hacia arriba). Los disacáridos se producen cuando se combinan químicamente dos monosacáridos mediante un enlace O-glucosílico. Consideremos tres de los más importantes disacáridos: la maltosa, la lactosa y la sacarosa. La hidrólisis de estos tres disacáridos produce diferentes combinaciones de monosacáridos: maltosa ->glucosa + glucosa lactosa ->glucosa + galactosa sacarosa ->glucosa + fructosa.-.-Un monosacárido se combina con otro y forma un acetal. Para sintetizar la mayoría de las moléculas de disacáridos, el átomo de carbono anomérico (átomo de carbono 1) de uno de los monosacáridos reacciona con un grupo -OH del cuarto o sexto átomo de carbono de otro monosacárido. El enlace que se forma se conoce como un enlace glucosídico, es decir, un enlace acetálico de la glucosa. Los enlaces glucosídicos también se denominan alfa o beta, dependiendo de si el átomo de oxígeno en el acetal está debajo (a) o encima (ß) del anillo. Los disacáridos, son solubles en agua, dulces, cristalizables y pueden hidrolizarse. Seran reductores cuando el carbono anomérico de alguno de sus componentes no está implicado en el enlace entre los dos monosacáridos. La capacidad reductora de los glúcidos se debe a que elgrupo aldehído o cetona puede oxidarse dando un ácido. Principales disacáridos con interés biológico. Maltosa.- Es el azúcar de malta. Grano germinado de cebada que se utiliza en la elaboración de la cerveza. Se obtiene por hidrólisis de almidón y glucógeno. Posee dos moléculas de glucosa unidas por enlace tipo a (1-4). Isomaltosa.- Se obtiene por hidrólisis de un polisacarido (la amilopectina y del glucógeno). Se unen dos moléculas de glucosa por enlace tipo a (1-6). Celobiosa.- No se encuentra libre en la naturaleza. Se obtiene por hidrólisis de la celulosa. y está formado por dos moléculas de glucosa unidas por enlace ß (1-4). Lactosa.- Es el azúcar de la leche de los mamíferos. Así, por ejemplo, la leche de vaca contiene del 4 al 5% de lactosa. Se encuentra formada por la unión ß (1-4) de la ß-D-galactopiranosa (galactosa) y la a-D-glucopiranosa (glucosa). Sacarosa.- Es el azúcar de consumo habitual, se obtiene de la caña de azúcar y remolacha azucarera. Es el único disacárido no reductor, ya que los dos carbonos anoméricos de la glucosa y fructosa están implicados en el enlace Glucosidico (1 a,2 ß).

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