CLONACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

7.1. LOS MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR

La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADNc basada en la tecnología de ADN recombinante: una aplicación importante de las endonucleasas de restricción en biología molecular que permite crear moléculas de ADN recombinante, las cuales se introducen en una célula huésped. Para la multiplicación de estas células en cultivo se consiguen multitud de copias de ADN recombinante y, por tanto, del fragmento amplificado de interés.

La clonación molecular implica:

1. La inserción del fragmento de ADN que se quiere amplificar en una molécula portadora o vector.
2. Introducción del vector en una célula viva hospedadora.
3. La selección y multiplicación en cultivo de las células.
4. Recuperación del fragmento amplificado.

Es una técnica manual y requiere varios días. Ventajas:

• Permite obtener prácticamente cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.
• Se pueden clonar secuencias de ADN de gran tamaño dependiendo del vector.
• Puede clonar un genoma entero, permitiendo crear librerías genómicas. Se pueden clonar simultáneamente todos los ARNm de una población de células en forma de ADNc (creación de librerías de ADNc).
• Posibilita la expresión de genes o de secuencias de interés, para la producción de proteínas, hormonas, etc., o en medicina como son la obtención de órganos transgénicos, terapia génica, etc.

7.2. COMPONENTES DE LA CLONACIÓN

7.2.1. LOS VECTORES DE CLONACIÓN

Son moléculas de ADN que pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y que permiten la inserción de ADN, sin perder esa capacidad de replicación autónoma.

El fragmento de ADN de interés que se introduce en el vector de clonación recibe el nombre de inserto.

CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES DE CLONACIÓN

• Tener un origen de replicación que le permita replicarse en la célula huésped.
• Tener, como mínimo, un sitio de inserción de ADN extraño: secuencias diana de enzimas de restricción, presentes una única vez en toda la molécula. Los vectores suelen tener múltiples dianas de restricción diferentes para posibilitar la inserción de casi cualquier ADN extraño. En algunos vectores, las dianas de restricción se concentran en un segmento corto del vector, denominado sitio de restricción o sitio múltiple de clonación.
• Contener algún marcador de selección, que permita distinguir las células que portan el vector de aquellas que no lo portan. Normalmente son genes de resistencia a antibióticos que codifican enzimas que no tiene de manera natural la célula huésped.
• Contener un marcador de identificación, que permita distinguir las células que portan un vector recombinante, con ADN extraño, de aquellos que portan un vector sin ADN extraño.

Algunos contienen un promotor, que posibilita la transcripción del inserto y la posterior traducción a proteína – vectores de expresión.

TIPOS DE VECTORES

Se diferencian por el origen de la molécula, la disposición de los distintos elementos que los integran y el tamaño del fragmento de ADN que pueden incorporar.

PLÁSMIDOS

Son moléculas circulares de ADN bicatenarias extracromosómicas de origen bacteriano con capacidad autónoma de replicación.

Se han diseñado multitud de vectores plasmídicos, modificándolos mediante ingeniería genética para mejorar sus prestaciones como vectores de clonación.

2 parámetros importantes:

• El tamaño del inserto que puede transportar.
• El número de copias de plásmido por célula que puede alcanzar tras su replicación en la célula hospedadora.

Los plásmidos más utilizados son:

• pBR322: puede transportar fragmentos de ADN (3,5 – 5kb).
• pUC18: aceptan insertos de hasta 10 kb y su alta tasa de replicación (500 copias), tiene polykinter y promotor.

BACTERIÓFAGOS

Son virus que infectan bacterias. El fago introduce su material genético en el interior de la bacteria; se adueña del control de la maquinaria metabólica de la célula infectada y desarrolla un ciclo lítico: replicación del cromosoma vírico, síntesis de proteínas víricas, el empaquetamiento de nuevos virus y la liberación de los mismos al medio previo lisis celular.

Alternativamente, insertan el material genético en el cromosoma de la bacteria mediante recombinación – ciclo lisogénico. Ej. Fago lambda (incluyen insertos de hasta 20 kb).

BACTERIÓFAGO M13

ADN monocatenarios, pero cuando infecta una bacteria se replica dando lugar a una molécula circular bicatenaria: forma replicativa (RF).

La RF se puede usar como vector de clonación. Cuando se introducen en una célula hospedadora, se replican automáticamente originando cadenas sencillas (con el inserto) que se empaquetan en viriones y son expulsadas al exterior por la célula (no hay lisis celular).
Estas cadenas sencillas amplificadas son muy útiles para secuenciación.

Etiquetas: ADN recombinante, bacteriófagos, clonación molecular, plásmidos, vectores de clonación