La radiación electromagnética (REM forma de energía radiante que tiene propiedades ondulatorias, propagándose en forma de ondas, y que queda caracterizada por: la longitud de onda se define como la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa en nanómetros.//La frecuencia (n) es el número de ciclos por segundo, y es inversa a la longitud de onda: ν=c/λ Además por su naturaleza dual, la luz se caracteriza por estar formada por paquetes discontinuos de energía «fotones». E=h×ν =h×c/λ  siendo h la llamada constante de Planck//Energía luz inversamente proporcional a λ y directa proporcional a la frecuencia. El espectro electromagnético amplio intervalo de energía desde los rayos g λ corta, hasta las ondas de radio λ larga. El espectro electromag se divide en regiones que abarcan intervalos de longitudes de onda. El ojo humano responde sólo a la REM comprendida entre 350 y 800 nm, que es la regíón visible, aunque la instrumentación del laboratorio suple nuestra limitación permitiendo realizar mediciones tanto del espectro de menor longitud de onda (ultravioeta, UV), como en las de mayor longitud de onda (infrarrojo, IR). La regíón visible es un conjunto de radiaciones que conocemos como luz blanca, pero es capaz de descomponerse en los colores del arco iris. Fenómenos de interacción entre la luz v la materia: cuando se produce una interacción entre un haz de radiación y la materia se producen fenómenos de «absorción» o «emisión». Esta radiación tendrá una longitud de onda determinada.Si representamos la absorción de radiación por una especie química a diferentes λ, obtendremos el espectro de absorción. Si representamos, la emisión de radiación a diferentes λ tendremos un espectro de emisión. En el caso de la absorción lo que sucede es que se producen tránsitos electrónicos desde un nivel inferior a uno superior. Cuanto mayor sea la diferencia de energía entre ambos niveles, mayor será la frecuencia de la radiación que se necesita y menor será por lo tanto λ. En un átomo supone el salto de los electrones exteriores desde un orbital de menor energía a otro de mayor energía.///Identificación en espectroscopía molecular visible uv. Espectros de absorción: cuando una molécula absorbe los electr que sufren un salto son los electr de enlace. Las moléc en constante movimiento de vibración, rotación y traslación asociados estados energéticos vibracionales, rotacionales y electrónicos. Si radiación de microondas (poca energía), se van a producir transiciones rotacionales. Si se corresponde a la radiación infrarroja, se producirán transiciones vibracionales. Si es luz visible o UV, se producirán transiciones electrónicas de las mismas carácterísticas.//La transición electrónica requerirá diferentes cantidades de energía para un mismo tránsito electrónico, y por lo tanto de radiaciones de distinta λ. En un espectro UV, visible de una molécula, existirán varios máximos de absorción, que suponen el solapamiento de varios saltos posibles entre subniveles.//La λ de la luz absorbida es aquella que tiene la energía requerida para mover un electrón desde un nivel de energía inferior a uno superior. Ciertos compuestos (moléculas) que presentan en su estructura grupos funcionales que aportan electrones n (no enlazantes) y electrones p (que forman los dobles enlaces), son capaces de realizar transiciones tras absorber energía radiante de longitud de onda correspondiente a la regíón visible y UV. Los electrones s (enlaces simples), necesitan radiaciones de menor λ (más energéticas).//Existe una serie de grupos químicos llamados cromóforos que, al estar presentes en la molécula, le confieren color y presentan absorción a longitudes de onda carácterísticas pertenecientes al rango Visible-Ultravioleta. Este es el caso del grupo 2 C=C, o del grupo C=O. Poseen dobles enlaces y electrones no compartidos. Otros grupos, llamados auxócromos, no producen color por si mismos, pero pueden desplazar, la longitud de onda del cromóforo hacia valores mayores o menores.//La zona de λ que se registra en un espectro UV- Vis es entre 200 y 800 nm. En esta zona no absorben dobles ni triples enlaces aislados. Solo van a absorber enlaces π conjugados y heteroátomos con pares de electrones no compartidos (O, N). A medida que aumenta la conjugación, los saltos electrónicos son de menor energía, y las moléculas absorben radiaciones de menor λ.// De esta manera podemos saber si podemos determinar directamente una sustancia por técnicas de Espectroscopía Molecular V-UV, conociendo su estructura. Haciendo el espectro sabremos que longitudes de onda podemos utilizar. Si no posee esta estructura podemos convertirla en otra que si la tenga, utilizando los reactivos necesarios y de la que conozcamos su espectro. De esta forma disponemos de una técnica cuyas carácterísticas son: La ESPECIFICIDAD. Prácticamente, todas las sustancias de interés absorben energía V-UV de una determinada λ por sí mismas, o bien pueden convertirse químicamente en compuestos capaces de absorber energía de una λ determinada. Analizando el espectro podemos escoger una λ a la cual no absorban otras sustancias presentes en la matriz de la muestra (interferencias).//La SENSIBILIDAD. En una determinación espectrofotométrica, el color de la luz que presenta la absorción máxima o casi máxima debe atravesar la solución. Analizando el espectro V-UV de la molécula de interés se puede seleccionar la λ más adecuada para una medida cuantitativa (λ a la que la absorción es máxima). Para ello cogeremos el pico más alto que no de lugar a interferencias.//LEY DE BEER: Se basa en la aplicación de la ley de Lambert-Beer, según la cual hay una relación lineal directamente proporcional entre la absorbancia y la concentración.
Utilizando patrones podemos comparar concentraciones con absorbancias y extrapolar la concentración de una MUESTRA PROBLEMA Cuando un haz de luz incide sobre una muestra en disolución (medio homogéneo), parte de esa energía queda retenida en la muestra (absorción) y parte de ella se transmite. Por tanto, la intensidad de esa radiación en el inicio, es mayor que su intensidad después de atravesar la muestra (I). La relación entre estas intensidades, se llama transmitancia (T).//Existe una relación logarítmica INVERSA entre la cantidad de energía transmitida (T) y la cantidad de 3 energía absorbida (absorbancia), esto es importante, ya que la energía que podemos detectar es la transmitida y no la absorbida. Lambert demostró que la cantidad de luz absorbida por la muestra es proporcional al camino recorrido por la luz (espesor del recipiente), y Beer demostró que la absorbancia de una muestra en disolución es directamente proporcional a su concentración. De esta manera, la ley de Lambert-Beer queda como sigue: A = a b c A = absorbancia. A = coeficiente de absorción o absorbitividad b = longitud de la solución en cm. C = concentración de la sustancia o absorbente. % T = porcentaje de transmitancia. Esta ecuación constituye la base del análisis cuantitativo de las determinaciones espectrofotométricas de absorción. Si nos fijamos esta ley relaciona la concentración (X) con una señal medible (Y), la absorbancia. Se va a fijar una de las variables que es el ancho de la cubeta que contiene la muestra a 1 cm. “Tenemos la ecuación de una recta”, y por lo tanto ya tenemos una forma de cuantificar la concentración de una determinada sustancia. Y=b X+a A=abC+0 Los valores de absorbancia no tienen unidades. El coeficiente de absorción es una constante relacionada con la naturaleza química del soluto. Si el ancho de la cubeta es de 1 cm, como dijimos, la ecuación de la recta queda de la siguiente forma: A=&épsilon;C+0///Cuanto mayor sea el coeficiente de extinción molar, (&épsilon;) en una sustancia para unas condiciones determinadas de trabajo, mayor será la absorbancia de ese compuesto en esas condiciones de trabajo y, por tanto, mayor será la sensibilidad del método que lo emplea. Si observamos la expresión de la ley, el coeficiente de extinción molar es la pendiente de la recta.//Si representamos gráficamente en un eje de coordenadas el % T frente a la concentración, obtenemos una curva en la que se observa que % T está inversa y logarítmicamente relacionado con la concentración, de tal manera que una disminución de la concentración produce un incremento logarítmico del % T. En tanto que si representamos la absorbancia frente a la concentración, debido a la ley de Lambert Beer, obtenemos una recta y la proporción entre ambas es directa, es decir, al disminuir la concentración disminuye la absorbancia. En los aparatos, la lectura que se realiza es la de la luz transmitida, que es la que llega al detector. Luego transforman el valor de la transmitancia, en absorbancia. // Procedimiento de medida: con esta técnica instrumental podemos identificar, utilizando una determinada 4 longitud de onda, y cuantificar aplicando la ley de BEER. Las longitudes de onda utilizadas van a ser las de la regíón visisble-ultravioleta. A veces podemos adivinar la longitud de onda al ver el color de la muestra a determinar. Cuando la sustancia a analizar (o la obtenida a partir de la misma por reacción química) posee un color es porque absorbe radiación visible, no ultravioleta. Cuanto mayor es la concentración de la sustancia a analizar más intenso es el color de la muestra. A menudo se hace referencia a la “estrella de colores” para facilitar el recordar el color de filtro para lectura colorimétrica. Para soluciones de color azul verde y amarilla correspondería un filtro rojo. Para soluciones de color rojo, naranja o amarillo seleccionaríamos un filtro color azul. Finalmente para soluciones con color verde, azul o amarillo elegiríamos un filtro rojo.//Para cuantificar se aplica la ley de Beer. La ley de Beer fundamenta los métodos experimentales más utilizados en clínica. Basándonos en la relación lineal entre absorbancia y concentración, podemos conocer la concentración de una solución problema de dos maneras: Por comparación con una solución conocida o empleo de factores de calibración, es lo que se llama una recta de 2 puntos (0 y un patrón o calibrador de concentración conocida).//CURVA (RECTA) DE CALIBRACIÓN. Es la representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancias (ordenadas), frente a concentraciones (abscisas). El método de trabajo con curva de calibración consiste en ensayar varias soluciones de concentraciones conocidas determinando sus absorbancias a una determinada longitud de onda; a continuación, se construye la curva de calibración (que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a las absorbancias gráficamente y se obtiene la recta de calibrado. Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentración se averigua por interpolación de las absorbancias en la recta de calibración. O despejando la concentración de la recta de calibrado.//Limitaciones de la ley de beer En las determinaciones fotométricas se debe conocer la «linealidad», que es el «intervalo de concentraciones» del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre la concentración y la absorbancia, es decir, se cumple la ley de Beer (rango analítico). Cuando la concentración de cromógeno en la solución sobrepasa los «límites de linealidad», la ley deja de cumplirse, convirtiéndose la recta de la gráfica en una curva que tiende a ser paralela al eje de abscisas, lo cual se traduce en que la lectura de absorbancia da lugar a una concentración falsamente baja de cromógeno; ante esta situación hay que diluir la muestra. También se produce desviación de la ley de Beer en los siguientes casos: Si la radiación incidente no es monocromática.//Si hay interferentes (otros cromógenos absorben también luz a esa l).////Cuando la absorción del solvente es significativa en comparación con la absorción del soluto.//Cuando la luz es transmitida por otros mecanismos.//Si se mide la absorción de una solución fluorescente. Un factor a tener en cuenta es que, antes de efectuar la lectura espectrofotométrica se debe hacer un blanco a fin de eliminar las posibles interferencias de absorción o reflexión por parte de la propia cubeta 5 o el solvente del cromógeno. Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta sólo con el solvente o solo los reactivos; se establecerá una intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solución, que marcará las condiciones iniciales de trabajo. La absorbancia del blanco se restará a las absorbancias que se midan para los problemas. A este blanco se le denomina «blanco de reactivos» (el solvente son los reactivos) y elimina las posibles interferencias que puede producir el reactivo. En el «blanco de suero» o blanco de muestra la lectura inicial se hace con el suero diluido en la misma proporción en un solvente inerte, con el que no reaccione; elimina las posibles interferencias que puede producir la propia muestra antes de que se produzca la reacción.

///Instrumentación: Todos los fotómetros y espectrofotómetros constan esencialmente de: fuente de energía radiante, rendijas de entrada y salida, sistema selector de longitud de onda, cubeta destinada a contener la muestra, detector de energía radiante y dispositivo de lectura de la señal generada por el detector.//Fuente de energía radiante: La misión de la fuente de energía es proporcionar energía radiante en forma de luz visible y/o no visible. Estas lámparas deben ser de gran intensidad y estables. Además deben cubrir un rango de longitudes de onda amplio. Lámparas de filamentos de tungsteno. Se utilizan habitualmente como fuentes de radiación para l del espectro visible y UV próximo; son fuente de un espectro continuo de energía radiante entre 360 y 950 nm. 2. Lámparas de hidrógeno y deuterio. Generan radiación por descarga en un medio gaseoso. Producen un espectro continuo en la regíón UV (220-360 nm.) más utilizada la de deuterio.//La cantidad de luz emitida por una lámpara no es constante en un intervalo continuo de l, presentando máximos y mínimos. Las lámparas sufren con las subidas y bajadas bruscas de tensión, lo que se traduce en cambios en las lecturas de las absorbancias. La lámpara tiene una vida limitada.//sistemas de selección de longitud de onda: Su finalidad es seleccionar la l, o intervalos de l, deseados para el análisis. Ningún selector de longitud de onda es capaz de producir radiación monocromática, sino que la salida es una franja de longitudes de onda contiguas, llamada banda. Las longitudes de onda se distribuyen en torno a una longitud de onda central denominada “longitud de onda nominal”. La “anchura efectiva es el rango correspondiente a la mitad de la altura del pico. Se clasifican en dos tipos: filtros y monocromadores.// FILTROS. Detienen por absorción ciertas radiaciones, y deja pasar otras. Tenemos los siguientes tipos: «Filtros de vidrio». Están compuestos por una o más capas de vidrios coloreados que absorben todas las radiaciones excepto una banda más o menos estrecha. Solo pueden ser utilizados en la regíón visible. Los «filtros de interferencia. Se usan con la radiación UV y visible. Se basan en los principios de interferencia óptica. Están construidos con un material dieléctrico de grosor adecuado, recubierto por ambos lados con una película de metal, que es suficientemente delgada para transmitir aproximadamente la mitad de la radiación que incide sobre ella y reflejar la otra mitad. Todo este conjunto se protege con dos placas de vidrio. El grosor de la capa de material dieléctrico determina la longitud de onda que se transmite. Cuando un haz de luz perpendicular a la superficie plateada penetra en el filtro de interferencia, pasa a través del dieléctrico y se refleja por la segunda superficie de plata a través del dieléctrico contra la primera capa, donde será reflejado otra vez, y así sucesivamente. Como resultado se obtienen en el lado opuesto a la llegada del haz de luz, una serie de haces paralelos. Que pueden sufrir interferencias constructivas y destructivas. Una «interferencia constructiva» sólo ocurrirá cuando la l de la luz equivale al espesor de la capa de fluoruro de magnesio o a un múltiplo de dicho espesor. La banda del que puede atravesarlos recibe el nombre de «paso de banda», de tal manera que sólo permanecen en fase las l múltiplos del espesor, mientras que las otras ondas son eliminadas debido a diferencias de fase. Hay dos tipos de monocromadores que se encuentran entre los más utilizados, las redes de difracción y los prismas. Sus componentes son los siguientes: Una lente colimadora (en los prismas) o espejo colimador (en las redes) para producir un haz paralelo. Elemento dispersante: un prisma o red. Un elemento de enfoque: lente (en prismas), espejo (en redes). Los monocromadores tienen el menor ancho de banda, es decir son los selectores de mayor precisión. En el caso de monocromadores de gran calidad, puede modificarse la rendija de salida y así disminuir el ancho de banda efectiva.///Estos proporcionan bandas espectrales de λ más estrechas que los filtros, y tienen la ventaja adicional de poderse ajustar fácilmente dentro de una amplia zona del espectro. El mecanismo principal se encuentra entre la rendija de entrada y la rendija de salida. Se diferencian entre si en el tipo de elemento dispersante. Hay dos tipos de monocromadores las redes de difracción y los prismas. Sus componentes son: Una lente colimadora (prismas) o espejo colimador (redes) para producir un haz paralelo. Elemento dispersante: un prisma o red. Un elemento de enfoque: lente (prismas), espejo (redes). Los monocromadores tienen el menor ancho de banda, es decir son los selectores de mayor precisión. En el caso de monocromadores de gran calidad, puede modificarse la rendija de salida y así disminuir el ancho de banda efectiva.///Los «prismas fragmentos con forma de cuña, de vidrio, cuarzo. Cuando el haz de luz atraviesa el prisma, su velocidad disminuye y se produce una refracción de la radiación, cambiando su dirección en el nuevo medio de propagación. La luz además se va a descomponer en diferentes haces que se corresponden con los distintos colores o λ. Moviendo la rendija de salida se consigue una u otra λ. El ángulo de emergencia de estos haces depende de λ de las radiaciones que lo integran. Las radiaciones de mayor frecuencia recorren el camino más corto, y las de frecuencia menor el más largo. //Las «redes de difracción». Dos tipos: redes de transmisión, y redes de reflexión, las más comunes. Estas últimas consisten en un gran número de hendiduras paralelas, situadas a distancias iguales entre sí, trazadas sobre un vidrio o una superficie metálica. Cuando un haz de luz incide sobre la superficie, se produce un fenómeno de difracción y la luz se dispersa en muchas direcciones. El proceso total sería el siguiente: la radiación policromática que entra por la rendija se colima mediante un espejo. Estos rayos inciden en una red de reflexión, donde se difractan, con ángulos distintos, las diferentes λ. La luz choca con un segundo espejo, que enfoca cada λ (cada color) en un punto distinto del plano focal. De acuerdo con la orientación de la red de reflexión, solo una banda estrecha de λ queda enfocada en la rendija de salida del monocromador. Girando la red, se logra que salgan por la rendija de salida diferentes longitudes de onda.//Cuando la superficie de una red es alcanzada por un haz de luz colimado puede considerarse que de cada surco sale un rayo de luz y que la radiación así emitida se superpone con la proveniente de los surcos vecinos, producíéndose interferencia, constructiva o destructiva según los casos. Cuando λ de la radiación es tal que la proyección de la separación entre surcos sobre la dirección del haz emitido (diferencia de caminos) es igual a un número entero de λ, las ondas están en fase y se produce «refuerzo» o interferencia constructiva. //SISTEMAS DE DETECCIÓN La luz transmitida, la no absorbida llega a un sistema de detección que debe transformar la señal luminosa en una señal eléctrica directamente proporcional. Es decir una corriente eléctrica que tendrá mayor o menor intensidad en amperios según el detector haya recibido mayor o menor radiación. Los tipos más empleados, tanto en las regiones del visible como del UV, son los fototubos multiplicadores y los fotodiodos de silicio. //Fototubos. Constan de un cátodo semicilíndrico y un ánodo de filamento, en el interior de un tubo en el que se ha hecho el vacío y hay establecida una diferencia de potencial. El cátodo va a emitir electrones cuando se irradia. El número de electrones emitidos es directamente proporcional a la potencia del haz de radiación y se dirigen hacia el ánodo, generando una corriente, que también será directamente 8 proporcional a la potencia de la radiación y que es la que se mide y se registra.//Fototubos multiplicadores. Son tubos de electrones capaces de amplificar de forma significativa una corriente. Se construyen utilizando como cátodo un material sensible a la luz (placa de metal), que emite electrones de forma proporcional a la energía radiante que incide sobre él. Los electrones producidos en esta primera etapa pasan a una segunda superficie del mismo metal en donde cada electrón produce entre 4 y 6 electrones; cada uno de estos electrones generados en la segunda capa pasa a otra (nivel de energía o dínodo) y produce de nuevo entre 4 y 6 electrones. Así, la corriente final producida por este tipo de tubo puede alcanzar niveles superiores entre 11000.000 o más veces la corriente inicial. Los fotomultiplicadores comunes poseen de 10 a 15 superficies de amplificación o dínodos. 3. Fotodiodos de silicio. Están construidos con silicio cristalino, un material semiconductor. Estos detectores emplean un gran número de diodos de silicio dispuestos lado a lado en un solo chip. Cuando una radiación UV-VIS cae en el diodo, su conductividad aumenta significativamente. Este aumento de la conductividad es proporcional a la intensidad de la radiación y se puede medir fácilmente. Dado que un gran número de diodos pueden ser organizados juntos, la intensidad en un número de longitudes de onda se puede medir de forma simultánea. Aunque el arreglo de fotodiodos no es tan sensible como el tubo fotomultiplicador, la posibilidad de ser capaz de medir un gran número de longitudes de onda hace que sea un detector de elección en los instrumentos rápidos modernos. DISPOSITIVOS DE LECTURA La señal eléctrica generada en el detector se lleva hasta los dispositivos de lectura adecuados, que reflejan su valor. Los sistemas de deflexión de aguja han sido sustituidos en la actualidad por los sistemas de lectura digital. En ambos casos, la señal eléctrica es reflejada en unidades de absorbancia o transmitancia. La introducción de microprocesadores permite cálculos directos de concentración con arreglo a factores de calibración prefijados, y lectura contra estándares, o curvas de calibración en memoria. 4.6. TIPOS DE APARATOS Según la disposición de los componentes fotométricos se pueden clasificar en: Espectrofotómetro de haz simple. Consta esquemáticamente de los componentes ya mencionados. La luz emitida pasa a través de un monocromador que seleccionará la l deseada; una rendijas de entrada consigue que el haz de luz sea estrecho y evitan la luz difusa; la luz pasa a través de la cubeta, donde se produce el proceso de absorción, y la luz no absorbida es transmitida al detector que convierte la energía radiante en eléctrica, la cual es registrada en un lector. A continuación se hace un blanco, colocando una cubeta con todos los componentes de la solución de trabajo, exceptuando el cromógeno, y haciendo un ajuste a 100% de transmitancia (0 A). Luego se hacen lecturas de los calibradores, patrones o estándares (concentración conocida). Por último se analizan las soluciones problema (concentración desconocida) y se averigua la concentración de éstas por comparación con los estándares (recta o regla de tres). Las medidas en los espectrofotómetros de un solo haz están sujetas a errores, debidos a fluctuaciones de la intensidad de la luz o a la inestabilidad del sistema de detección. Además, cuando se realizan medidas a varias l, es necesario ajustar el blanco en cada ocasión. Para solventar estos problemas se usan aparatos de doble haz. Espectrofotómetro de doble haz. Se clasifican en dos tipos: “en el espacio” y “en el tiempo”: 1. Espectrofotómetro de doble haz en el espacio. Todos los componentes están duplicados menos la 9 lámpara. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo a través de los diferentes componentes separados en el espacio. La señal procedente del blanco se va a restar automáticamente de la procedente de la muestra. Esta disposición compensa las variaciones de intensidad de la fuente. De energía radiante. Espectrofotómetro de doble haz en el tiempo. Normalmente utilizan los mismos componentes que un instrumento de haz simple. Dos haces de luz pasan a través de los mismos componentes, pero no al mismo tiempo. Después de la rendija de salida se inserta un interruptor rotatorio del haz luminoso («chopper’), que consiste en una rueda giratoria con secciones plateadas y rendijas alternas. Un sistema de espejos dirige la porción de luz reflejada por el interruptor rotatorio a través de una cubeta de referencia y de la muestra y de ahí al detector común. El detector ve alternativamente el haz de luz procedente de la muestra y de la referencia. La diferencia o proporción de las señales cronometradas se amplifica a continuación y resulta proporcional a la sustancia de interés presente en la cubeta de la muestra. Este sistema compensa la variación de la fuente de energía radiante así como las variaciones de sensibilidad del detector.