Espectrofotometría de Absorción Atómica con Atomización de Llama y Electrotérmica

1. Fundamento

La espectrofotometría de absorción atómica se basa en el fenómeno de absorción de luz por un átomo que se encuentra en su estado basal o fundamental, lo que origina el desplazamiento de sus electrones a niveles orbitales más energéticos y, por lo tanto, menos estables.

Los átomos excitados tienden a recuperar su estado basal, menos energético, emitiendo la energía absorbida como una radiación electromagnética de longitud de onda semejante a la radiación absorbida y característica de cada elemento.

En la espectrofotometría de absorción atómica, el elemento a analizar debe encontrarse en un estado atómico neutro -no excitado ni ionizado, estado basal.

La obtención de átomos en estado basal a partir de la muestra –proceso de atomización– se puede obtener de varias formas las cuales dan nombre a la técnica:

• Espectroscopia de absorción atómica con atomización de llama (F-AAS: Flame Atomic Absorption Spectroscopy)
• Espectroscopia de absorción atómica con atomización electrotérmica o cámara de grafito (GF-AAS: Graphite Furnace Atomic Absorption Spectroscopy)

En la espectroscopia de absorción atómica, los átomos NO SON EXCITADOS POR LA LLAMA -únicamente disocia los enlaces químicos obteniendo átomos no excitados ni ionizados- sino por una LÁMPARA que emite luz de longitud de onda específica -la que emite el metal que forma el cátodo y la que emiten los átomos que queremos cuantificar si son excitados.

Los átomos en estado basal son capaces de absorber una radiación emitida por una lámpara de cátodo hueco, construida del metal a analizar y que emite el espectro de líneas característico de éste (luz monocromática). La banda de longitudes de onda que absorbe cada especie absorbente es muy estrecha y específica, por lo que se conoce con el nombre de espectro de absorción característico.

En esta técnica se MIDE la atenuación de la luz incidente -absorción de la luz- debida a las interacciones de los fotones con los átomos en estado fundamental que se encuentran en el vapor atómico.

A medida que el número de átomos se incrementa, aumenta la cantidad de luz absorbida por lo que se cumple la ley de Lambert-Beer (aunque en teoría existe una relación lineal entre la concentración de átomos y la absorbancia, esto no se cumple estrictamente en las curvas de calibración)

En la FOTOMETRÍA DE LLAMA se excitan de 1 a un 5 % de los átomos situados en la llama mientras que en la ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA todos los átomos en estado energético basal son capaces de absorber la luz emitida por la lámpara.

La espectroscopia de absorción atómica con atomización de llama (F-AAS) es una técnica muy relacionada con la fotometría de llama ya que se utiliza una llama para atomizar la disolución de la muestra. Ahora bien, en la espectroscopia de absorción atómica existe una fuente independiente de luz monocromática, específica para cada elemento a analizar, y que se hace pasar a través del vapor de átomos, midiéndose posteriormente la radiación absorbida.

Es una técnica sensible, exacta, precisa y muy específica.

La espectrofotometría de absorción atómica es muy utilizada para la determinación en el laboratorio de análisis clínicos de CALCIO, MAGNESIO, COBRE, ZINC, PLOMO Y OTROS METALES.

2. Instrumentación en Espectrofotometría de Absorción Atómica

Los espectrofotómetros de absorción atómica abarcan desde instrumentos muy sencillos de haz simple hasta diseños complejos automatizados. La mayoría de los instrumentos se diseñan de modo que puedan utilizarse en fotometría de llama.

Los equipos para espectrofotometría de absorción atómica constan de:

1. Fuente de luz:
   • Lámpara de cátodo hueco
   • Lámpara de descarga sin electrodos
2. Modulador (chopper).
3. Atomizador (proceso de atomización):
   • Atomización con llama (quemador).
   • Atomización electrotérmica
4. Sistema selector de longitud de onda (Monocromador).
5. Componentes fotométricos.
6. Microprocesador electrónico

2.1. Fuente de Luz

Los espectrofotómetros de absorción atómica comerciales siguen el siguiente esquema de funcionamiento:

• El haz de luz procedente de la LÁMPARA DE CÁTODO HUECO llega al interruptor rotatorio (CHOPPER) que permite su paso través de la llama o refleja la luz originando un haz de referencia.
• Los haces pasan alternativamente a través del mismo monocromador al detector, es decir, aprecia primero el haz de referencia y a continuación utiliza este valor para comparar el valor del haz de referencia y del haz procedente de la muestra. Cuanto más átomos hay en la llama, mayor será la cantidad de luz absorbida y mayor la diferencia de intensidad entre el haz de la muestra y el de referencia. Esta diferencia se amplifica y se envía a un sistema de lectura.

FUENTE DE LUZ:

Tiene su origen en una lámpara capaz de emitir una radiación MONOCROMÁTICA (de una longitud de onda o de una banda estrecha de longitudes de onda) ESPECÍFICA para el elemento a analizar. Las más utilizadas son las lámparas de cátodo hueco y la lámpara de descarga sin electrodos.

2.1.1. Lámpara de Cátodo Hueco

Su diseño le permite EMITIR el espectro de líneas correspondiente al elemento a analizar.

La lámpara de cátodo hueco está formada por un cilindro de vidrio sellado en cuyo interior hay un ÁNODO de wolframio y un CÁTODO cilíndrico hueco cuyas paredes interiores están revestidas del mismo elemento a determinar o de una aleación del mismo, por tanto, para cada metal se necesita una lámpara distinta aunque existen lámparas cuyo cátodo está formado por una aleación de varios elementos que permiten analizar varios parámetros.

En el interior de estas lámparas se encuentra un gas inerte -neón o argón- a una presión de algunos milímetros de mercurio. Como ventana de salida a la radiación se utiliza cuarzo o un vidrio especial que permita la transmisión de la radiación.

Para el funcionamiento de la lámpara de cátodo hueco se suministra una corriente eléctrica al cátodo, que hace que se liberen átomos (Mo) del elemento de que está construido, llenándose la cámara con vapor atómico de este metal.

Los átomos (Mo) colisionan con los átomos del gas inerte produciéndose la excitación de los mismos. Cuando regresan a su estado fundamental emiten una energía radiante de una longitud de onda característica que será absorbida por los átomos de la muestra que se encuentran en estado atomizado.

2.1.2. Lámpara de Descarga sin Electrodos

Están formadas por una pequeña cantidad del mismo elemento a determinar (analito) o una sal del mismo situada en un tubo sellado de cuarzo que contiene un gas inerte a baja presión.

El tubo está rodeado de una bobina de radiofrecuencia y protegido por una carcasa de cerámica con una ventana de cuarzo.

Cuando se aplica un potencial a la lámpara, el gas se excita y vaporiza el metal o su sal.

Los átomos del metal se excitan al chocar contra los átomos del gas emitiendo, al volver a su estado basal, la radiación característica del elemento que será la radiación absorbida por los átomos del analito en estado atómico.

La lámpara de descarga sin electrodos:

• emite luz de mayor intensidad por lo que
• permite analizar elementos volátiles o aquellos cuya concentración en la muestra sea muy pequeña pero
• tardan más tiempo en alcanzar la estabilidad siendo ésta superior a la alcanzada por las lámparas de cátodo hueco;
• su duración es mayor pero presentan el inconveniente de su mayor coste.

2.2. Modulador

El modulador está formado por FILTROS o DISCOS METÁLICOS (chopper) situados entre la fuente de luz y el sistema selector de longitud de onda.

Su función consiste en REGULAR LA SALIDA LA RADIACIÓN de forma intermitente hacia la llama -el modulador interrumpe la radiación monocromática procedente de la lámpara de forma periódica- o refleja la luz originando un haz de referencia.

2.3. Atomizador (proceso de atomización)

2.3.1. Atomización con Llama (Quemador)

Su función es situar el elemento a analizar en un ESTADO ATÓMICO NEUTRO que le permita la absorción de la luz.

La muestra debe ser una DISOLUCIÓN y debe seguir, básicamente, dos procesos:

• la NEBULIZACIÓN de la muestra o transformación de la muestra en un aerosol antes de ser introducida en la llama y,
• la ATOMIZACIÓN, que ocurre en el interior de la llama, en la que el solvente se evapora y da lugar a la liberación de los átomos.

La mezcla de la muestra, en forma de aerosol, y los gases va a salir por la parte superior del quemador donde se forma la llama.

La composición de la llama puede ser de oxígeno o aire mezclado con acetileno, propano, hidrógeno o gas natural y su temperatura debe ser suficiente para liberar los átomos en su estado fundamental pero no excitarlos.

_______Hay dos tipos de quemadores:

• DE CONSUMO TOTAL: Los gases y la muestra se mezclan en la llama; presenta la ventaja de que se obtienen temperaturas más elevadas en la llama y la desventaja de la presencia de gotas grandes que provocan ruido de fondo.
• MECHEROS DE PREMEZCLA: La nebulización de la muestra se produce antes de su introducción en la llama. La temperatura que se obtiene no es tan elevada por lo que no se disocian todos los enlaces del analito. Como ventaja, el ruido de fondo es menor que en los quemadores de consumo total.

_______Ventajas:

• Q. de consumo total: Falta de la llama.
• Q. mecheros premezcla: las gotas grandes no pasan a la llama.

Inconvenientes:

• Q. cons total: gotas grandes que provocan ruido de fondo.
• Q. mech premezcla: llama no tan caliente.

_______La secuencia del PROCESO DE ATOMIZACIÓN mediante llama es el siguiente:

1. Aspiración.
2. Nebulización.
3. Mezcla de la muestra (aerosol) con los gases.
4. Desolvatación.
5. Volatilización.
6. Atomización.

_______La muestra es una disolución que es ASPIRADA por un capilar, con un caudal predeterminado (L/min.), hasta el nebulizador. La aspiración de la muestra se debe al efecto Venturi -disminución de la presión alrededor del capilar que lleva la muestra debido al incremento de velocidad de salida del gas por la disminución del diámetro del cilindro que lo conduce-.-.-.-.-.En el nebulizador las gotas de la muestra disminuyen de tamaño transformándose en un aerosol. Posteriormente, la muestra pasa a la cámara de premezcla donde se reduce aún más el tamaño de las partículas – mediante spoiler o bolas de impacto- y se mezclan las nubes de aerosol con los gases de combustión.-.-.-.-.Una vez la muestra ha llegado a la llama se produce la DESOLVATACIÓN o evaporación rápida del líquido que contiene el analito – suero, plasma…- y la VOLATILIZACIÓN o disociación de las moléculas del analito en estado sólido al gaseoso. El proceso finaliza con la ATOMIZACIÓN o ruptura de los enlaces del analito con otros átomos liberándose el átomo elemental.

3.2. Atomización Electrotérmica

Actualmente la llama puede ser reemplazada por otros métodos de atomización, lo que se DENOMINA ABSORCIÓN ATÓMICA SIN LLAMA._.-.-.-.El más empleado es el horno de grafito (GF-AAS) Graphite Fumace Atomic Absorption Spectroscopy) que aporta mayor sensibilidad y selectividad y se emplea para la determinación de metales pesados como el plomo..-.-..En el proceso de atomización electrotérmica, la muestra (unos pocos microlitros):

• se introduce directamente en el tubo de grafito
• estableciéndose una diferencia de potencial que provoca una subida progresiva de la temperatura que
• primero evapora la muestra y,
• posteriormente a una temperatura más alta, provoca la calcinación de la misma y la obtención de los átomos del elemento a cuantificar.

_______La elevación de la temperatura se realiza de forma controlada mediante un programa de atomización de temperaturas y tiempos que consta de las siguientes fases:

1. Secado
2. Mineralización
3. Atomización
4. Limpieza del tubo.-.-.-..En cada etapa se distinguen dos fases:

• tiempo de rampa – tiempo necesario para alcanzar la temperatura determinada- y
• tiempo de permanencia -a esa temperatura-.

-.-.-.-.Cada etapa, excepto la atomización, puede tener subetapas para evitar subidas bruscas de temperatura que conlleven la volatilización del analito antes de su atomización.-.-.-.Obtenemos de forma gráfica el PERFIL DE ATOMIZACIÓN DEL ELEMENTO que nos permite determinar la concentración del elemento (plomo, selenio…) en la muestra. Las mediciones de concentración son generalmente determinadas de una curva de calibración, después de haber calibrado el aparato con los estándares de concentración conocida.-.-.-.-.Los volúmenes de muestra oscilan entre 0.5 y 100 ìl y se alcanzan temperaturas elevadas -alrededor de 3.000º C-. Se pueden detectar concentraciones hasta mil veces más pequeñas que con la atomización de llama.

2.4. Sistema Selector de Longitud de Onda

El monocromador nos permite aislar la luz de longitud de onda que nos interesa eliminando las energías radiantes procedentes de la llama.-.-.-.El monocromador está situado entre la muestra y el detector; está formado por REDES DE DIFRACCIÓN DE ALTA CALIDAD y tiene como función seleccionar radiaciones de una longitud de onda de rango muy estrecho y coincidente con el espectro de absorción característico del analito.-.-.-.La radiación entra en el sistema a través de la RENDIJA DE ENTRADA, se refleja en un espejo e incide sobre la RED DE DIFRACCIÓN -lámina de vidrio o metálica con estrías que dispersa el haz de luz- dispersando las longitudes de onda que la componen en distintos ángulos. Mediante un segundo espejo se dirige hacia la RENDIJA DE SALIDA la longitud de onda seleccionada.

2.5. Componentes Fotométricos

Pueden ser espectrofotómetros de haz simple o de doble haz; estos últimos permiten la obtención de mejores lecturas y hay de dos tipos:

• Espectrofotómetro de doble haz en el espacio.
• Espectrofotómetro de doble haz en el tiempo.-.-.-.-.

La radiación llega al DETECTOR (dispositivo encargado de captar la señal óptica proveniente del monocromador y transformarlo en una señal electrónica capaz de ser convertida en un valor legible).-.-.-.El detector más utilizado es un tubo FOTOMULTIPLICADOR (tubo de vacío provisto de placas fotosensibles que recibe los fotones, los convierte en impulsos electricos y los multiplica hasta obtener la suficiente intensidad eléctrica para ser cuantificada) que nos permite obtener la señal que será procesada para obtener información.

2.6. Microprocesador Electrónico

Permite procesar los datos obtenidos en el fotomultiplicador y transformarlos en:

• una señal gráfica en pantalla o
• en impresora.-.-.-.Este microprocesador está integrado en el equipo y, mediante un teclado nos permite:
• seleccionar la magnitud a determinar (absorbancia, transmitancia, altura de pico, área de pico…)
• las condiciones de medida (longitud de onda, expansión de la escala, tiempo de integración…)
• registrar los valores de señal obtenidos por los estándares en el método de la recta de calibrado,
• ajustar por mínimos cuadrados la recta,
• interpolar valores de señal de las muestras problema a la recta de calibrado…-.-.-.-..Es conveniente medir la absorción de un estándar cada vez que se realiza un análisis; la desviación que presente el estándar puede utilizarse para corregir los resultados.-.-.-.Tanto el método basado en la curva de calibración como el de adición de estándares son adecuados para determinaciones cuantitativas.

3. Aspectos Prácticos

Mantenimiento: el problema más importante es mantener el quemador en condiciones para proporcionar una llama estable para lo cual se requiere un flujo de gas controlado y mantener la cabeza del quemador limpia.

Fenómenos de interferencia: de gran importancia en las determinaciones. En el cuadro adjunto se clasifican el tipo de interferencia, las características de la misma y el modo de evitarlas si es posible.

Interferencias Espectrales o de Emisión:

• Características: son producidas por la existencia de elementos con líneas de emisión próximas a las de absorción del analito. Son poco frecuentes pero se interpretan como menos absorción por parte del analito y por tanto la concentración del analito parece menor.
• Modo de subsanarlas: utilización de un monocromador capaz de discriminar longitudes de onda próximas a la que nos interesa.

Interferencias Químicas:

• Características: se deben a la reacción del elemento a analizar con otras sustancias presentes en la muestra que dan origen a complejos que la llama no puede disociar o a desequilibrios de disociación en el sistema de atomización. Podemos encontrar tanto un aumento como una disminución de la absorbancia sobre la señal.
• Modo de subsanarlas: se evita añadiendo soluciones de elementos que desplazan al elemento de interés de esas uniones químicas indeseables por mayor afinidad por el anión. Ej: solución de lantano para determinación de calcio.

Interferencias de Ionización:

• Características: una de las causas puede ser la alta temperatura de atomización que hace aparecer iones en vez de átomos en estado fundamental. Estos no absorben la radiación incidente con lo que parece que la concentración del analito está disminuida.
• Modo de subsanarlas: se puede evitar añadiendo un exceso de una sustancia fácilmente ionizable que libera electrones al medio y que posteriormente reaccionan con los iones del analito a cuantificar los cuales vuelven al estado basal, o reduciendo la temperatura de la llama.

Etiquetas: atomización electrotérmica, detector, espectrofotometría de absorción atómica, interferencias, lámpara de cátodo hueco, llama, monocromador