Introducción a la cromatografía en columna

La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de proteínas. Consiste en la aplicación de una muestra compleja de proteínas a una columna de cristal en la que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las diferentes proteínas se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Según la matriz escogida, las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamañó o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.
En toda cromatografía hablaremos de los siguientes términos :

Matriz de la columa

Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina el lecho de la columna.

Longitud de la columna

Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.

Volumen de la columna

Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica.

Volumen muerto de la columna

Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína.
En general, y dependiendo del tipo de cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna.

‘Run Throught’

Es, en columnas de intercambio iónico o de afinidad, el volumen de solvente más proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella. Correspondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente que contiene las proteínas no afines al ligando.

Tipos de cromatografía en columna

El principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar : peso molecular, carga eléctrica, afinidad de una de ellas por alguna otra, etc… En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna:

cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínasmdependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.

Cromatografía de filtración en gel

La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido.

Cromatografía en capa fina

La cromatografia en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Los requisitos son un absorbente, placas , un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de absorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas.

La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.

Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

hidrocarburos < olefinas=»»>< fluor=»»>< cloro=»»>< nitro=»»><>

aldehído < ester=»»>< alcohol=»»>< cetonas=»»>< aminas=»»>< ácidos=»»><>

Aplicación de las muestras

Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación, lo más común es usar acetona. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 µg de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas.

Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se denomina toque.

Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar.

Etiquetas: Cromatografía en columna factores que influyen, Mecanismos que determinan la separación en cromatografía, Propiedad de retencion cromatografia, Reveladores quimicos en cromatografia, Tipos de reveladores en cromatografia