Características Deseables en Vegetales

Características de protección:

• Resistencia a insectos
• Tolerancia a herbicidas
• Resistencia a hongos
• Resistencia a virus
• Resistencia a bacterias
• Resistencia a nematodos
• Tolerancia ambiental

Características de calidad:

• Demora de la maduración
• Aceites modificados
• Proteínas modificadas
• Alto contenido de sólidos
• Producción de anticuerpos, enzimas, etc.

Ejemplos:

• Tabaco: se cultiva en la actualidad tabaco exento de nicotina para la proyectada introducción de cigarrillos sin nicotina
• Algodón: para el control del gusano de las yemas y el gusano del copo de algodón
• En maíz: control del barrenador y otras larvas plaga. Se ha incorporado una versión modificada del gen cry de Bacillus thuringiensis en el ADN de la propia planta, de tal modo que la maquinaria celular de la planta produce la toxina.

Transferencia de ADN Usando Vectores Biológicos

• Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes.
• Sistemas basados en virus vegetales.

Descripción del plásmido Ti:

• ADN-T, que es lo único que se transfiere.
• Posee BI, BD, gen de biosíntesis de hormona vegetal, gen de síntesis de opina, genes vir que provocan la transferencia del trozo T.
• Genes de catabolismo de opinas (que permiten que la bacteria se nutra de estas sustancias).
• El ADN-T entra al núcleo y se inserta al azar en algún sitio del genoma. Se expresan sus dos genes en: hormonas (provoca crecimiento descontrolado); opinas, sustancia que la planta excreta.
• La planta se ha convertido en una especie de esclava metabólica que mantiene el crecimiento de la bacteria en el seno del tumor de la agalla.

Transferencia Directa de ADN

• Por biobalística. (Shot Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula.
• Por cationes divalentes y/o electroporación. Usa descarga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear.
• Por fusión de protoplastos. La exposición de las membranas al polietilenglicol (PEG), facilita el movimiento de las moléculas de ADN.
• Por microinyección.

Vectores a partir del plásmido Ti

Suelen ser de uno de dos posibles tipos:

• Vectores binarios
• Vectores recombinativos (cointegrativos)

• «Vacía» el interior del ADN-T, dejando de él sólo los bordes (imprescindibles), sustituye dos genes: uno es un marcador para localizar o seleccionar las células que se va a transformar; el otro es el gen que queremos poner a trabajar en la planta.
• Ahora introducimos nuestro vector (con la correspondiente construcción genética) en una cepa de Agrobacterium a la que hemos «desarmado» su plásmido Ti (con objeto aprovechar sus funciones de transferencia del ADN-T, pero inactivándole sus funciones patógenas).

Vectores virales:

• Virus del mosaico de la coliflor: CaMV.
• Virus del mosaico del tabaco TMV

Infección viral sistémica en la planta: Se han combinado plásmidos derivados de Ti y de vectores virales

Ventajas:

• Facilidad de infección.
• Rango de hospederos más amplio.
• Alta expresión de genes bajo control de promotores.

Procedimiento en la generación de una planta transgénica

1. Identificar un carácter deseable.
2. Encontrar algún organismo que lo exprese.
3. Encontrar el gen responsable del carácter deseado.
4. Combinar el gen con otros elementos para que sea funcional en la planta.
5. Mover los genes a las células de la planta.
6. Encontrar células modificadas y regenerarlas en plantas completamente funcionales.

Objeciones a los cultivos transgénicos

• Daño a la salud humana. La alergenicidad. La transferencia horizontal y la resistencia a los antibióticos. La ingestión de ADN extraño (el promotor del virus del mosaico de la coliflor).
• Modificación de la concentración de nutrientes.
• Daño al medio ambiente.
• Flujo de genes desde los cultivos a la maleza.
• Resistencia a los antibióticos.
• Filtración de proteínas transgénicas en el suelo.
• Reducción real del uso de plaguicidas.
• Modificación de las prácticas actuales de cultivo.
• Flujo de genes de un cultivo a otro.
• Perturbación de las prácticas y economías tradicionales en los países menos desarrollados.

Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial

Condiciones económicas:

• Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg).
• Alto rendimiento y productividad del cultivo comparado con la planta entera.
• Buen crecimiento en biorreactores.
• Crecimiento lento de la planta entera como fuente alternativa.

Parámetros principales:

• Productividad: g de producto/L/día.
• Concentración máxima de producto: g de producto/L
• Rendimiento: g producto/g sustrato.

Métodos usados para optimizar la producción de metabolitos secundarios

• Selección de especies vegetales apropiadas.
• Selección de líneas celulares mejoradas.
• Optimización de las condiciones de cultivo.
• Agregado de precursores.
• Tipo de cultivo: suspensiones, órganos o célula inmovilizadas.
• Uso de elicitores microbianos y estrés abiótico.
• Permeabilización y remoción in situ.

Screening y selección de líneas sobreproductoras

• Se facilita cuando el metabolito de interés es un pigmento, ya que puede hacerse una selección visual.
• Es importante contar con un método rápido y sencillo para seleccionar líneas más productoras (por ejemplo, ELISA).

Optimización del medio de cultivo (variables más ensayadas)

• Fuente de carbono.
• Limitación en nitrógeno.
• Limitación en fosfato.
• Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas).
• Relación C/N.

Agregado de precursores

• Bajo costo.
• Baja toxicidad.
• No muy alejado del producto final en la ruta metabólica.

Cultivos en suspensión

Problemas a considerar:

• Tasa de crecimiento.
• Volumen del inóculo.
• Tamaño y agregación de las células.
• Oxigenación.
• Agitación.

Elicitación

Los elicitores son moléculas del patógeno que interactúan con receptores de la planta, activando en ella, respuestas de defensa.

Agentes bióticos

• Extractos de paredes de hongos o bacterias.
• Acido araquidónico.
• Quitosano.
• Metil jasmonato.

Agentes abióticos

• Metales pesados.
• Radiación UV.
• Presión osmótica.
• Ultrasonido.

Liberación del producto al medio

• Dimetilfulfóxido (DMSO).
• Shock térmico.
• Cambios de Ph.
• Limitación de fosfato y oxígeno.
• Elicitación.
• Detergentes y aceites de siliconas.
• Electropermeabilización.

Secuencia en la optimización de un proceso para la producción de metabolitos secundarios

1. Selección de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro.
2. Establecimiento de cultivos in vitro.
3. Estabilización y selección de cultivos in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto, liberación al medio.
4. Optimización de medio de cultivo para producción por diseño factorial: nutrientes, precursores, elicitación, liberación y remoción in situ.
5. Optimización en bioreactores: escalado. Sistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusión, en dos etapas. Extracción y purificación del producto.

Estrategias para modificar el metabolismo secundario mediante manipulación genética

-Completar rutas metabólicas mediante   inserción de  genes heterólogos. -Amplificar rutas normales.- Bloquear rutas alternativas. -Bloquear rutas normales.- Modificar la regulación de rutas normales.- Modificar los mecanismos de secreción   y  exportación.- Bloquear rutas de degradación.PRODUCCIÓN DE SHIKONINA POR SUSPENSIONES CELULARES DE LITHOSPERMUM ERYTHRORHIZON*Planta entera– La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años.* Suspensiones celulares– 2 -4 días se estimula el crecimiento pero no la producción.- Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducenla producción de shikonina.- Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio.- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Etiquetas: ADN, biotecnología vegetal, cultivos transgénicos, ingeniería genética, metabolitos secundarios, plantas transgénicas, vectores