La Replicación del ADN

Recordad, una célula, antes de duplicar, tiene que hacer una copia de su material genético, de manera que las dos células «hijas» tengan su material genético correspondiente. A este proceso biológico se denomina replicación del ADN, y se trata de un proceso semiconservativo. Esto significa que cada cadena (hebra) de la doble hélice del ADN funciona como molde para la síntesis de las nueva(s) hebra(s) (ver figura 1). Para que la ADN polimerasa pueda acceder a la hebra molde que va a replicar, hacen falta un número de enzimas (helicasas, etc.) que van a abrir y «desenredar» (fijaros en el lado derecho de la figura) ambas hebras, dándole acceso a la ADN polimerasa a las dos hebras «abiertas». Este es un proceso que sucede en cualquier tipo de organismos independientemente de la temperatura óptima de crecimiento (mesófilos, psicrófilos o termófilos). Este proceso de replicación sucede en todo organismo vivo cuando las células duplican. Es un proceso in vivo (que sucede en células vivas).

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacción de PCR es un proceso in vitro (que sucede en condiciones artificiales, por ejemplo, en un tubo de PCR) en el que una secuencia ADN molde es copiada múltiple veces. De hecho, la definición estricta es una reacción que amplifica el número de copias de un ADN molde.

La reacción de PCR se desarrolló a partir de tres descubrimientos/invenciones:

1. La Taq Polimerasa

En los años 70, microbiólogos que trabajan en el estudio de organismos tolerantes a altas temperaturas se dan cuenta de que dichos microorganismos crecen a muy altas temperaturas. De esta manera, se dan cuenta de que, si este es el caso, estos organismos deben necesariamente tener ADN polimerasas resistentes a dichas altas temperaturas (que en principio se creía que no podían albergar ningún tipo de vida). A finales de los años 70, bioquímicos son capaces de purificar la ADN polimerasa, que se denomina Taq polimerasa por provenir del organismo Thermus aquaticus (figura 2). Sin embargo, no está muy claro cómo hacerla funcionar en ensayos in vitro. Llevó dos décadas descubrir cómo hacerlo, y comercializar la primera Taq polimerasa.

A modo de resumen, para poder hacer una reacción de ADN era necesaria la presencia de:

• (a) Mg²⁺,
• (b) era necesaria el que hubiese «cebadores», y
• (c) era esencial la presencia de nucleótidos libres

2. Temperatura vs ADN

Desde hacía tiempo, se sabía que se podían separar hebras complementarias de ADN mediante el incremento de la temperatura de solución, de manera que no es necesario usar enzimas del tipo helicasa. La temperatura de separación de la hebras dependía de factores como lo larga que fuese la secuencia (números de nucleótidos) y el %GC (G≡C presenta triple enlace, mientras que la A=T presenta un doble enlace). A efectos prácticos, cuanto mayor es el %GC, mayor será la temperatura a la que las dos hebras de la secuencia de ADN se separan (a esto se le llama etapa de desnaturalización). Así que, teóricamente, modulando la temperatura, se podían separar hebras de ADN (desnaturalizar), y bajando las temperatura ambas hebras se alinearían de nuevo.

3. El Termociclador

Basado en lo aprendido en el 2º descubrimiento, era posible desarrollar una máquina que fuese cambiando la temperatura a los tubos donde se hacía la reacción de PCR, por un tiempo determinado. De manera que fuese automatizada una secuencia de temperaturas en ciclos, esta es la razón principal por la que a una máquina de PCR se la llama termociclador.

¿Cómo es la Reacción de PCR y qué Limitaciones Tiene?

Ya sabemos que un cromosoma de E. coli que tiene alrededor de 5 Megabases (Mbs), eso quiere decir que tiene 5 millones de nucleótidos en su secuencia que codifica poco mas de 4200 genes. En los tiempos anteriores a la PCR, si queríamos trabajar con uno de esos genes, teníamos que hacer un cultivo de varios litros de E. coli (con un número muy alto de células), recolectarlas, y aislar el ADN. Para trabajar con ese gen, teníamos que cortar las regiones laterales, y purificarlo. Esto era un trabajo muy laborioso.

Con la PCR, lo que podemos hacer es crecer un pequeño volumen de E. coli (5 ml sobra), aislar el ADN (con un poco basta), y diseñar cebadores (en naranja) que sean complementarios a las zonas de los extremos de ese gen (ver figura). A una temperatura en que ambas hebras se separasen quedarían expuestas a la unión de esos cebadores que se unen específicamente basado en sus secuencia. Es en ese sitio, donde el cebador se une a la secuencia de ADN complementaria en el cromosoma, es donde la polimerasa a una temperatura concreta se va a unir (72°C), y va a «extender» en la dirección 3´->5´. Por extender entendemos la síntesis de una hebra de ADN complementaria del molde, y para ello va a hacer falta nucleótidos libres y Mg²⁺ (además de la Taq). Este sistema va a permitir hacer muchísimas copias de ese gen en muy poco tiempo. La progresión de nuevas hebras va a ser parecida a la manera en que un cultivo de bacterias evoluciona (progresión de 2ⁿ). De esta manera, si solo hay una copia de ADN, y hacemos 30 ciclos de extensión en nuestra PCR, tendremos 2³⁰, o lo que es lo mismo 10⁹ copias de ese gen, en apenas 1-2 h, y por un coste/labor ínfimo.

La PCR tiene varias fases (ver la siguiente figura):

1. Una desnaturalización de 1-2 minutos a 90+°C
2. Una desnaturalización de unos poco segundos a 90+°C
3. Un alineamiento de los cebadores/oligos a una temperatura basada en su %GC, de unos pocos segundos
4. Una extensión a 72°C, por un tiempo que depende de cómo de largo sea la región de ADN a extender (lo normal es alrededor de 1000 nt=1kb por minuto)
5. Una desnaturalización de 1-2 minutos a 90°C
6. Reacción acabada, se mantiene los tubos a 4°C

Los pasos 2-4 son los que se repiten, hasta 30-40 ciclos dependiendo de la vida media de la Taq polimerasa.

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