Enfoque de Estudio de la Metabólica

Dentro de los estudios metabólicos se pueden distinguir tres estrategias analíticas: el enfoque global o no dirigido, el perfil metabólico y el enfoque dirigido.

La elección de métodos apropiados es indispensable.

Muestras Biológicas

• Modelo celular
• Tejidos
• Biofluidos

Preparación de la Muestra

• Temple
• Extracción
• Muestras de control de calidad

Adquisición de Datos

• NMR
• GC-MS
• LC-MS

Preparación de Datos

• Corrección de líneas de bases
• Detección de picos
• Alineación máxima
• Normalización

Análisis Estadístico

• Análisis multivariable
• Cargando puntos
• Pruebas de permutación
• Análisis univariables

Identificación de Componentes

• Estándares
• Base de datos espectral
• Literatura

Herramientas Metabolómicas

Debido al tamaño diverso, hidrofobicidad y volatilidad de los metabolitos, las técnicas utilizadas para identificar y cuantificar el metaboloma deben ser muy sensibles para garantizar que los metabolitos no se excluyan durante la preparación de las muestras.

Son tres las técnicas que caracterizan a la metabolómica: espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear, ambas técnicas de detección, y cromatografía, una técnica de preparación.

Técnicas Metabolómicas

Técnicas de Separación

• Cromatografía de líquidos
• Cromatografía de gases

Técnicas de Detección

• Espectrometría de masas
• Espectroscopia de resonancia magnética nuclear

Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

Fue desarrollada a finales de los años cuarenta para estudiar los núcleos atómicos.

• En 1951, los químicos descubrieron que la espectroscopia de resonancia magnética nuclear podía ser utilizada para determinar las estructuras de los compuestos orgánicos.
• Pueden utilizarse solo para estudiar núcleos atómicos con un número impar de protones o neutrones (o de ambos). ¹H, ¹³C, ¹⁹F, ³¹P son núcleos magnéticamente activos.
• La RMN es una técnica espectroscópica que se basa en la absorción y reemisión de energía de los núcleos atómicos debido a las variaciones de un campo magnético externo.
• El hidrógeno es el núcleo más comúnmente seleccionado (¹H-RMN) debido a su abundancia natural en las muestras biológicas, aunque pueden utilizarse otros núcleos para obtener información metabólica complementaria.

Cambios Cuánticos de la RMN

Se utiliza una radiación de baja energía.

La RMN usa la Radiación para Obtener Información

• La muestra es estimulada mediante la aplicación de la energía.
• Antes de aplicar el estímulo, el análisis se encuentra predominantemente en un estado de energía más bajo, estado basal.
• El estímulo causa que algunas de las especies de analito experimenten una transición hacia un estado de mayor energía o estado excitado.
• Adquirimos información sobre el analito, midiendo la radiación electromagnética emitida conforme regresa a su estado basal o midiendo la cantidad de radiación electromagnética absorbida como resultado de la excitación.

Fundamentos de la RMN

• El protón en la misma dirección del campo tiene una menor energía.
• El protón en dirección contraria tiene mayor energía.
• La intensidad del campo afecta la separación de los espines, a mayor distancia mayor resolución.

Espectrometría de Masas (MS)

Es una técnica analítica capaz de identificar un amplio conjunto de moléculas midiendo su peso molecular como la relación masa-carga.

• En un espectrómetro de masas, las partículas cargadas ionizadas se detectan eléctricamente, mientras que en un espectrógrafo de masas, los iones son evaluados mediante fotografía o herramientas no eléctricas.
• Los instrumentos disponibles en la actualidad suelen utilizar detectores eléctricos, por lo que esta técnica suele denominarse MS.

¿Qué Puede Hacer la MS?

• Se puede identificar compuestos desconocidos, investigar la estructura y las propiedades químicas de diferentes clases de analitos e identificar y cuantificar compuestos diana incluso en muestras complejas.
• Estos diferentes objetivos pueden perseguirse utilizando distintos tipos de espectrómetros de masas diseñados mediante la combinación de fuentes y analizadores con características especializadas.

La alta resolución, precisión, sensibilidad y la responsabilidad de llevar a cabo múltiples análisis condujeron a una enorme difusión de la MS.

¿Qué Obtengo de la Técnica de MS?

El resultado es una gráfica, llamada espectrómetro de masas, donde se recorta la abundancia relativa vs la relación masa/carga.

Muestra – Sistema de introducción de muestras – Fuente de ionización – Analizador – Detector – Procesos de señales – Dispositivo de lectura.

• La espectrometría de masas es una técnica para estudiar las masas de átomos, moléculas o fragmentos de moléculas.
• Las moléculas gaseosas o las especies desorbidas de fases condensadas se ionizan, los iones se aceleran en un campo eléctrico y a continuación se separan según su relación masa/carga (m/z).

Espectrómetro de RMN

Aprovecha las propiedades magnéticas de los protones para obtener información sobre la estructura de una molécula y por lo tanto sobre su identidad.

• La muestra se coloca en un campo magnético intenso y se utiliza radiación electromagnética en forma de pulsos de radiofrecuencias para excitar los protones.
• Los espectrómetros actuales pueden trabajar a 200 a 950 MHz, la potencia está relacionada con la sensibilidad.

Partes de un Equipo RMN

Consola. En la RMN solo hay cambios de espín.

• Se utiliza una radiación de larga energía.

Interpretación

Número de hidrógenos vecinos, multiplicidad, regla N+1.

• La multiplicidad de las señales está relacionada con el número de hidrógenos vecinos al que da la señal.

Desplazamiento

En la práctica es difícil medir el campo magnético al que un protón absorbe con suficiente exactitud para distinguir protones individuales, ya que las absorciones solo varían en unas pocas milésimas.

• Un método más exacto para expresar el desplazamiento químico es determinar el valor respecto a un compuesto de referencia que se añade a la muestra.

H: 0 y 12.5, C: 0 a 250 y P: 200 a 250.

Apantallamiento

Consiste en la atenuación de la fuerza de atracción del núcleo sobre un electrón debido a la repulsión de otros electrones (cuanto más alejado esté un electrón del núcleo, más apantallado estará).

Espectrometría de Masas

Es una técnica para estudiar las masas de átomos, moléculas o fragmentos de moléculas.

• Las moléculas gaseosas o las especies desorbidas de fases condensadas se ionizan, los iones se aceleran en un campo eléctrico y a continuación se separan según su relación masa/carga (m/z).
• El área debajo de cada pico es proporcional a la abundancia de cada isótopo.

Todos los MS Tienen Tres Componentes

• Fuentes de iones
• Analizadores de masas
• Detector

¿Cómo Sucede la Ionización Electrónica?

Las moléculas que entran en la fuente de ionización se convierten en iones por ionización electrónica.

• Los electrones emitidos por un filamento caliente (como el de una bombilla) son acelerados a través de un potencial de 70V antes de que interactúen con las moléculas entrantes.

Intercambio Iónico

Se emplea el uso de resinas de intercambio iónico, con lo que se busca retener sobre su superficie. Es usado en la eliminación de sales en bajas concentraciones.

Adsorción

Este proceso es la captación de sustancias solubles en la superficie de un sólido. Se utiliza para eliminar fenoles, hidrocarburos aromáticos. Adsorbente más utilizado: carbón activado. Adición adecuada de cloro libre para la proliferación de microorganismos.

Cromatografía

Se basa en el principio de que los componentes de una mezcla se separan cuando la mezcla, añadiéndose a una fase estacionaria (en la mayoría de los casos, una superficie sólida), provocará que algunos componentes de la mezcla se adhieran a la fase estacionaria. Al mismo tiempo, el resto pasa junto con la fase móvil.

Existen Diferentes Tipos de Cromatografía

• Una amplia gama de procedimientos cromatográficos aprovechan las diferencias de tamaño, afinidades de unión, carga y otras propiedades para separar materiales.
• Permite separar los componentes de una mezcla en función de su naturaleza, estructura, tamaño y otras propiedades.

Fase Estacionaria

Consiste en una partícula sólida o líquida adherida a una superficie de vidrio o metal sobre la que se absorben selectivamente los componentes de la mezcla que se desea separar.

• La mayoría de las sustancias utilizadas son porosas, lo que permite la fijación de los componentes durante la cromatografía.
• La fase estacionaria a seleccionar depende de la naturaleza de los componentes a separar y del tipo de cromatografía.
• Según el tipo de cromatografía, se utiliza como fase estacionaria: perlas de gel, papel fino y uniforme, sílice, vidrio, algunos gases o incluso componentes líquidos.

Fase Móvil

Es la fase líquida o gaseosa que se hace pasar por un sistema cromatográfico en el que los componentes de la mezcla se separan a diferentes velocidades absorbiéndose a la fase estacionaria.

• Transporta la mezcla a medida que se desplaza por la fase estacionaria.
• Las sustancias utilizadas como fase móvil se seleccionan para un proceso cromatográfico en función de la naturaleza de los componentes que se van a separar y del tipo de cromatografía.
• El alcohol, el agua, el ácido acético, la acetona o algunos gases son las fases móviles utilizadas habitualmente en diferentes técnicas cromatográficas.

Cromatografía de Gases

Es una cromatografía gas-líquido.

• Su fase móvil consiste en gases como He o N₂. La fase móvil, que es un gas inerte, se hace pasar por una columna de alta presión.
• La muestra que se va a analizar se vaporiza y entra en la fase móvil gaseosa. Los componentes contenidos en la muestra se dispersan entre la fase móvil y la estacionaria en el soporte sólido.
• La cromatografía de gases es una técnica sencilla, poliédrica, muy sensible y de rápida aplicación para la separación extremadamente excelente de moléculas muy diminutas.

Requerimientos de los Compuestos

• Suficiente volatilidad: Los analitos deben tener suficiente volatilidad para poder transportarse a través de la columna.
• Estabilidad térmica: Los compuestos de interés no se deben degradar cuando se introducen en el inyector a alta temperatura o en la columna.

Compuestos Orgánicos

• Compuestos orgánicos muy volátiles (gases): WOC 0-100, benceno, butano, adelgazantes de pintura.
• Compuestos orgánicos volátiles (COV): formaldehído, tolueno, acetona, desengrasantes.
• Compuestos orgánicos semivolátiles: SVOC 240-400, plaguicidas.

Inyector y detector de un CG.

La mayoría de los suministros de gas utilizados deben estar comprendidos entre el 99.995% y el 99.9995% de pureza y contener niveles bajos (

Gas Auxiliar o Supletorio

• Los detectores por lo general necesitan de gases auxiliares de alta pureza para su buen funcionamiento, independientes de los gases portadores.
• De este modo, FID (detector por ionización de llama), NPD (detector de nitrógeno fósforo) y FPD (detector fotométrico de llama) necesitan una mezcla de aire sintético e hidrógeno para crear la llama. ECD (detector de captura de electrones) funciona con una mezcla de metano en argón o nitrógeno.
• Los TCD (detector de conductividad térmica) emplean los mismos gases portadores del sistema.

Detectores típicos de cromatografía de gases y sus límites de detección.

Etiquetas: análisis metabólico, biofluidos, cromatografía, Espectrometria de masas, metabolómica, NMR, resonancia magnética nuclear, tejidos