Las enzimas necesarias para estas modificaciones son reclutadas por el dominio C terminal de la ARN polimerasa II. En primer lugar, se añade el cap (cuando el ARN mide más de 25 nucleótidos), después va el splicing (los intrones se retiran según son reconocidos tras su síntesis) y finalmente la poliadenilación, que permite que la polimerasa no siga unida al ADN y se pueda terminar el proceso de transcripción.

Adición del Cap en el Pre-mRNA

El cap consiste en un nucleótido modificado que se adiciona al extremo 5′ del pre-mRNA. Este nucleótido es una 7-metilguanosina, en el carbono 7 de la base nitrogenada se ha añadido un grupo metil.

La unión se produce entre el carbono 5′ de la ribosa del cap y el carbono 5′ de la ribosa del primer nucleótido de ARN. Una fosfohidrolasa elimina el fosfato gamma del primer nucleótido, reaccionando (gracias a la guanililtransferasa) la 7-metilguanosina con ese extremo. Esta enzima añade un GTP a los dos fosfatos que han quedado en el primer nucleótido.

En el proceso se desprende el pirofosfato del GTP y ya quedarían los dos C5′ unidos a través de tres grupos fosfato, uno del GTP y dos del último nucleótido. Por tanto, no se producen enlaces 5′-3′.

Además, en los dos primeros nucleótidos de ARN se produce la metilación del C2′ de la ribosa.

A continuación, se añade el metil al C7′ de la guanina del cap. Se utiliza el compuesto S-Ado-Met como donador del grupo metil, se cataliza por la guanidin-7-transferasa. Después, las enzimas llamadas 2-O-metil-transferasas vuelven a usar S-Ado-Met para metilar los C2′ de los dos primeros nucleótidos.

La función del cap 5′ es proteger al ARN de la acción de las nucleasas, que degradarán los ácidos nucleicos desde el extremo 5′ si no hay un cap que los proteja. Esta protección es posible ya que al haber una unión 5′-5′ en el principio del ARN y no una unión 5′-3′, las exonucleasas son incapaces de reconocer esa estructura y degradarla. Esto también sirve como una señal o marca de que esa molécula de mRNA es un pre-mRNA.

Splicing del Pre-mRNA

A la hora de realizar el splicing, hay una serie de puntos críticos que son fundamentales para este proceso.

Son el punto 5′ de splicing (entre dos guaninas, ahí acaba el exón y comienza el intrón), el punto 3′ de splicing (también entre dos guaninas, aquí acaba el intrón y comienza otro exón), una adenina que es un branch point (punto de ramificación) y una región con muchas pirimidinas (polypyrimidine tract).

Tenemos un primer ARN nucleolar pequeño de tipo U1 complementario al punto 5′ de splicing, que sigue hacia el primer exón. Tenemos otro snRNA U2 complementario al punto de ramificación y que se continúa hacia el segundo exón, pero a partir de esta zona se pierde la complementariedad (aunque sigue apareándose).

Estos snRNAs servirán como marcadores que serán reconocidos para la eliminación de los intrones.

En el punto 5′ de splicing (entre el primer exón y el intrón) tenemos el snRNA U1.

También se une la proteína SF1 y el U2AF, factores accesorios para el snRNA U2. Una vez que estos factores se han unido, el SF1 sale del pre-mRNA y ya se podrá unir también el U2 al punto de ramificación (nucleótido de adenina).

Ahora entran los snRNAs U4, U6 y U5 para formar un complejo llamado espliceosoma.

Se producirá la primera reacción de transesterificación; se formará un nuevo enlace fosfodiéster entre el punto de ramificación (ese nucleótido de adenina) y el principio del primer intrón.

A continuación, ocurre una segunda transesterificación que unirá el extremo 3′ del primer exón (el final) con el extremo 5′ del segundo exón (su principio). Así conseguimos tener los dos exones juntos sin el intrón.

Lo que hace el espliceosoma es aproximar los nucleótidos del ARN donde se van a romper y formar los enlaces. Los ARN pequeños van a catalizar la ruptura y formación de enlaces. Necesitamos el splicing para tener un mRNA maduro con la secuencia correcta para que este pueda ser traducido a proteína.

Adición de la Cola de Poli-A en el Pre-mRNA

La cola de Poli-A protege al mRNA de las 3′ exonucleasas. La primera señal de poliadenilación es la secuencia AAUAAA, después está el sitio de poliadenilación, y finalmente la segunda señal de poliadenilación, que es una secuencia rica en uracilo y guanina (o sólo uracilo).

Cuando estas señales aparecen, se unirá el factor específico de corte y poliadenilación a la primera señal.

También tendremos el factor de estimulación del corte unido a la segunda señal. Estos factores interaccionan entre ellos, provocan que el mRNA se curve, y en esta curva se van a unir los factores de corte 1 y 2.

Finalmente se une la enzima Poli-A polimerasa al sitio de poliadenilación. El pre-RNA se corta entonces entre quince y treinta nucleótidos después de la primera señal de poliadenilación.

Una vez que se hace el corte, la ARN polimerasa II y los factores de corte y el de estimulación se van. La enzima Poli-A polimerasa empieza a añadir As (adeninas) al final de la cadena utilizando ATP. Cuando haya doce As, se les unirá una proteína de unión a la cola de Poli A. Esto estimula la Poli-A polimerasa y se añaden otras doce adeninas, y así sucesivamente hasta llegar a los 200-250 nucleótidos de adenina.

Una vez puesta la cola de Poli-A, tenemos un ARN cubierto casi totalmente de proteínas. El EJC es un complejo de reconocimiento de las uniones entre exones, nos está diciendo que ya se ha hecho el splicing, tenemos el mRNA maduro y listo. Cuando ya está listo el mRNA, los EJC sirven como adaptador para que el ARN sea reconocido por las exportinas que van a exportar el ARN del núcleo al citoplasma. En el citoplasma va a haber una serie de helicasas que utilizan ATP para separar todas esas proteínas que estaban unidas al ARN.

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