Fundamentos de la PCR Convencional

La PCR convencional, o PCR de punto final, es una técnica fundamental en biología molecular que permite la amplificación selectiva de una secuencia específica de ADN in vitro. Este proceso se lleva a cabo utilizando un equipo llamado termociclador.

El término «punto final» se refiere a que los resultados se obtienen al finalizar todo el proceso. La PCR permite obtener millones de copias idénticas de un fragmento de ADN a partir de una cantidad mínima de material genético, lo que facilita su posterior estudio o uso en otras técnicas. Su alta sensibilidad es una ventaja clave, pero también un desafío debido a la susceptibilidad a la contaminación con ADN exógeno. Por lo tanto, es crucial trabajar siguiendo estrictas medidas para prevenir la contaminación cruzada y por microorganismos.

Mecanismo de la PCR

La PCR imita el proceso natural de replicación del ADN, utilizando enzimas y aprovechando las propiedades fisicoquímicas del ADN. A continuación, se describen las analogías y diferencias con la replicación in vivo:

• Topoisomerasas y helicasas: En la replicación in vivo, estas enzimas desenrollan el ADN. En la PCR, su función se sustituye por la desnaturalización térmica de las dos cadenas de ADN.
• SSBP (Single-Stranded Binding Proteins): No son necesarias en la PCR debido a la desnaturalización térmica.
• ADN polimerasa (ADN pol): Se utiliza una ADN polimerasa termoestable que puede resistir las altas temperaturas de desnaturalización.
• dNTPs (desoxinucleótidos trifosfato): Se añaden los cuatro dNTPs energéticos (adenina, guanina, citosina y timina).
• Primers (cebadores): No se utiliza ARN polimerasa para sintetizar el primer, ya que se añaden primers sintéticos. Se utilizan juegos de primers específicos, diseñados para flanquear el fragmento de ADN que se desea amplificar.

La PCR consiste en la repetición de 30-35 ciclos cortos de replicación. Cada ciclo comprende tres fases principales:

1. Desnaturalización: Separación de las dos hebras de ADN mediante calor (94-95°C).
2. Hibridación (Annealing): Unión de los primers a las secuencias complementarias en el ADN molde (50-65°C).
3. Elongación (Extensión): La ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN a partir de los primers (72°C).

El proceso se repite en cada ciclo, y tanto el ADN molde original como las nuevas cadenas formadas sirven como molde para las siguientes copias. Esto resulta en un aumento exponencial del número de copias del fragmento de ADN diana (amplicón).

Amplicón y Utilidades de la PCR

El amplicón es el fragmento de ADN delimitado por los primers, es decir, la región específica que se desea amplificar y secuenciar.

La PCR fue ideada por Kary Mullis en 1983, quien recibió el Premio Nobel por su descubrimiento. Las aplicaciones de la PCR son amplias y diversas:

• Diagnóstico y pronóstico de enfermedades.
• Seguimiento de la evolución y respuesta a tratamientos.
• Estudios de expresión génica.
• Mutagénesis.
• Estudios filogenéticos.
• Medicina forense (identificación de personas mediante polimorfismos genéticos).

Es importante destacar que el descubrimiento de la ADN polimerasa del bacteriófago Φ29 por Margarita Salas fue crucial para el desarrollo de la PCR.

Etapas Detalladas de la PCR Convencional

Cada ciclo de PCR se compone de las siguientes etapas:

1. Desnaturalización del ADN molde (94-95°C): Una fase inicial de 1-5 minutos, seguida de 15-30 segundos en cada ciclo. Es crucial que la temperatura y duración sean suficientes para desnaturalizar todo el ADN sin inactivar la ADN polimerasa.
2. Hibridación o Annealing de los primers (50-65°C): Dura entre 30-60 segundos. La temperatura depende de la temperatura de fusión (Tm) de los cebadores (Tm ± 5°C). Una temperatura más alta aumenta la especificidad, pero reduce el rendimiento. Una temperatura más baja aumenta el rendimiento, pero puede generar productos inespecíficos.
3. Extensión o Elongación (72°C): Se realiza a la temperatura óptima de la ADN polimerasa (Taq ADN pol: 72°C). La duración depende de la velocidad de polimerización de la enzima y la longitud del fragmento. Hay una fase de elongación en cada ciclo y una elongación final más larga.
4. Enfriamiento (4°C): Para conservar las muestras.

Al final de la PCR, después de ‘n’ ciclos, el número teórico de amplicones es 2ⁿ, y el número de productos no deseados es 2 x n. Sin embargo, el rendimiento real de la técnica nunca es del 100%.

Componentes de la PCR

• Agua de grado de biología molecular: Libre de DNasas e inhibidores de PCR.
• ADN molde: ADN del paciente o muestra a analizar.
• Primers (cebadores): Oligonucleótidos monocatenarios (18-24 bases) complementarios a las regiones que flanquean el ADN a amplificar. Se utilizan en pares (Forward y Reverse).
• ADN polimerasa (ADN pol): Enzima termoestable que sintetiza la nueva cadena de ADN.
• dNTPs: Desoxinucleótidos trifosfato (A, T, C, G) en igual concentración.
• Tampón (Buffer): Proporciona el pH y la concentración salina óptimos para la actividad de la ADN pol.
• Cloruro de magnesio (MgCl₂): Cofactor esencial para la ADN polimerasa.

Primers: Diseño y Características

• Longitud: 18-30 bases.
• Composición de bases: G + C entre 40-60%.
• Extremo 3′ OH: Evitar 3 o más G/C consecutivas para prevenir uniones inespecíficas.
• Temperatura de fusión (Tm): 52-65°C. La diferencia de Tm entre ambos cebadores debe ser menor de 0.5°C. La Tm se calcula mediante la Regla de Wallace: Tm = 2(A+T) + 4(G+C).
• Secuencias complementarias: Evitar secuencias complementarias intra e intermoleculares para prevenir la formación de horquillas y dímeros.

ADN Polimerasas Termoestables

Se utilizan ADN polimerasas termoestables (provenientes de bacterias termófilas) que mantienen su actividad después de la incubación a 95°C. Presentan diversas actividades:

• Actividad exonucleasa 5′-3′: Elimina nucleótidos desde el extremo 5′ de la cadena.
• Actividad exonucleasa 3′-5′: Actividad correctora que elimina nucleótidos erróneos.
• Actividad transcriptasa inversa: Capacidad de sintetizar ADN a partir de un molde de ARN (ADNc). Requiere manganeso (Mn²⁺).

Parámetros clave para elegir una ADN polimerasa:

• Velocidad de polimerización: Velocidad de incorporación de nucleótidos.
• Fidelidad de polimerización: Número de errores por millón de nucleótidos incorporados.
• Procesividad: Tiempo que la enzima permanece unida a la cadena sintetizando.

La Taq ADN polimerasa tiene una tasa de error de aproximadamente 1 cada 9000 nucleótidos, mientras que la Pfu ADN polimerasa tiene un índice de error de 1 en 1.3 millones de pares de bases, pero es más lenta.

ADN polimerasas Hot Start: Estas polimerasas se comercializan bloqueadas por un anticuerpo monoclonal que impide la polimerización a temperatura ambiente. El anticuerpo se desnaturaliza a 95°C, permitiendo que la polimerasa comience a actuar a su temperatura óptima.

Preparación de la Mezcla de Reacción (Master Mix)

La mezcla de reacción, o Master Mix, contiene todos los reactivos necesarios para la PCR (excepto el ADN molde) a la concentración de trabajo adecuada. Los reactivos se diluyen con agua ultrapura hasta la concentración deseada para un volumen final determinado (25 o 50 µl). Se utiliza la fórmula de las diluciones (Vo x Co = Vf x Cf) para calcular los volúmenes.

El Mix contiene:

• Agua ultrapura.
• Tampón (Tris con cloruro potásico, pH 8.3-9).
• Cloruro magnésico (MgCl₂).
• dNTPs (200 µM de cada uno).
• Primers F y R (200-400 nM cada uno).
• ADN polimerasa (1-2.5 unidades para un volumen final de 50 µl).

Se prepara un Mix para un número de muestras que incluye: número de muestras + control positivo + control negativo + 20% de volumen extra. El volumen extra compensa las pérdidas durante el pipeteo.

En cada microtubo de PCR se añade:

• Volumen de Mix de reactivos.
• Volumen de ADN a analizar.
• Control Positivo: Mix + ADN control.
• Control Negativo: Mix + agua de grado biología molecular.

Preparación del ADN Molde

El ADN molde no se incluye en el Mix, pero su volumen debe considerarse en los cálculos. Se recomienda usar ADN purificado. La calidad y cantidad son cruciales:

• Calidad: Alto grado de integridad, libre de proteínas e inhibidores de la PCR.
• Cantidad: ADN genómico humano: 100-300 ng (no exceder 500 ng para 50 µl de volumen final).

En algunos casos, se pueden añadir potenciadores de la PCR (DMSO, glicerol). Es importante recordar que existen inhibidores de la PCR (hemo, anticoagulantes, etanol).

Programación del Termociclador y Análisis de Resultados

El termociclador se programa según las condiciones de trabajo y el software del equipo. Después de la PCR, los productos amplificados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa (0.5-2.0%) junto con un marcador de peso molecular.

Resultados esperados:

• Resultado positivo: Una única banda del tamaño esperado. El control negativo (blanco) no debe mostrar ninguna banda. Si aparece una banda en el control negativo, indica contaminación.
• Resultado negativo: Ausencia de la banda específica. El control positivo debe mostrar una banda para validar la reacción. Si no aparece la banda en el control positivo, los resultados no son válidos.
• Bandas inespecíficas: Indican amplificación de secuencias no deseadas.

Análisis de Errores y Control de la Contaminación

Los errores en la PCR pueden deberse a:

• Contaminación.
• Mala calidad del ADN extraído.
• Concentración inadecuada de la Master Mix.
• Diseño inadecuado de los primers.
• Temperaturas inadecuadas.

Recomendaciones para el control de la contaminación:

• Utilizar controles negativos.
• Utilizar reactivos de grado biología molecular.
• Adición controlada de agentes antimicrobianos (azida de sodio al 0.025%).
• Utilizar pipetas exclusivas para PCR y puntas con filtro.
• Trabajar con materiales libres de nucleasas.
• Trabajar en una habitación limpia con luz ultravioleta.
• Preparar la mezcla de reacción en un área de preamplificación.
• Flujo de trabajo unidireccional.

Efectos de una Cantidad Inadecuada de Reactivos

Magnesio (Mg²⁺):

• Forma un complejo soluble con los dNTPs.
• Estimula la actividad polimerásica.
• Aumenta la Tm de la interacción cebador/ADN molde.
• Influye en la especificidad: el exceso produce amplificaciones inespecíficas.
• Influye en la formación de dímeros de primers.

Una baja concentración de Mg²⁺ reduce el rendimiento, mientras que una alta concentración genera productos inespecíficos. La concentración óptima de Mg²⁺ suele ser de 1.5 mM para la Taq polimerasa, pero debe optimizarse experimentalmente.

Efectos de una Temperatura Inadecuada

• La temperatura de hibridación influye en la especificidad de los primers.
• Una temperatura demasiado alta reduce o elimina el producto.
• Una temperatura demasiado baja genera productos inespecíficos.

Purificación del Producto de PCR

Después de la amplificación, es necesario purificar el producto de PCR para eliminar el exceso de nucleótidos y primers. Existen varios métodos comerciales, como la eliminación enzimática (ExoSap-IT):

Se añaden 2 µl de ExoSap-IT a 5 µl de producto de PCR. Se incuba a 37°C durante 4 minutos y luego a 80°C durante 1 minuto. La primera incubación digiere el exceso de cebadores y nucleótidos, y la segunda inactiva las enzimas.

Otras Modalidades de PCR

PCR Múltiplex (Multiplex PCR)

Permite la amplificación simultánea de múltiples secuencias diana en una sola reacción, utilizando varios pares de primers (hasta 8). Los diferentes primers deben tener una Tm similar. Los productos se pueden identificar mediante electroforesis en gel de agarosa (si tienen tamaños diferentes) o electroforesis capilar (si tienen tamaños similares y están marcados con fluorocromos diferentes). Permite la inclusión de un control positivo interno.

Interpretación de resultados:

• Positivo: Dos bandas (la estudiada y la de control).
• Negativo: Solo la banda de control.
• PCR no válida: Ninguna banda.

RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

Permite amplificar y analizar moléculas de ARN (como el ARNm). Consta de dos etapas:

1. Síntesis de ADNc: La transcriptasa inversa sintetiza ADNc a partir del ARN molde.
2. Amplificación del ADNc: La ADN polimerasa amplifica el ADNc.

Los primers para la retrotranscripción pueden ser:

• Hexanucleótidos aleatorios.
• Oligo-dT (se une a la cola poli-A de los ARNm).
• Un cebador específico de la PCR posterior.

Se utiliza para estudios de expresión génica.

PCR en Tiempo Real (qPCR o PCR Cuantitativa)

Permite cuantificar el producto de la amplificación en tiempo real (mientras ocurre la amplificación) y cuantificar el ADN molde inicial. Los componentes de la mezcla de reacción son similares a la PCR convencional, pero se añade un marcador fluorescente intercalante o unido a una sonda que hibrida con los amplicones.

Se utiliza un termociclador a tiempo real con un lector de fluorescencia. La fluorescencia emitida se mide en cada ciclo y se procesa mediante un software. La cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de amplicón formado y, por lo tanto, a la cantidad de ADN inicial.

Ventajas de la qPCR frente a la PCR convencional:

• Mayor resolución y sensibilidad.
• No requiere procesamiento post-PCR (ahorro de tiempo).
• Mayor rapidez en la detección cualitativa.
• Minimiza la contaminación por amplicones (si se utiliza una sonda específica).
• Resultados más fiables.

Cinética de Amplificación

La cuantificación de la fluorescencia en cada ciclo se representa en una gráfica llamada cinética de amplificación, que presenta tres zonas:

1. Zona de ruido: Primeros ciclos; el número de amplicones está por debajo del nivel de detección.
2. Zona de crecimiento exponencial: La producción de amplicones es exponencial y la fluorescencia aumenta.
3. Zona de meseta: Disminución del rendimiento por agotamiento de sustratos, pérdida de actividad enzimática, etc.

En la gráfica se establecen:

• Baseline (Línea de base): Nivel de ruido en los primeros ciclos.
• Threshold (Línea umbral): Línea que separa la fluorescencia positiva del ruido. Se ajusta por encima del fondo y dentro de la región lineal de la curva.
• Ciclo umbral (Ct) (Threshold cycle): Ciclo en el que la curva de amplificación cruza el umbral. Un Ct menor indica una mayor cantidad inicial de ADN diana.

Aplicaciones de la qPCR

• Cuantificación de la cantidad inicial de ácido nucleico (carga viral, expresión génica).
• Detección cualitativa: Si la fluorescencia supera el Ct, la muestra es positiva.

qPCR con SYBR Green

Utiliza marcadores fluorescentes intercalantes como SYBR Green I, que aumenta su fluorescencia al intercalarse en el ADN de doble hélice. La fluorescencia se mide al final de la fase de extensión. Presenta baja especificidad, ya que se une a cualquier molécula de ADN de doble cadena.

Aplicación en la detección de mutaciones: Técnica High Resolution Melting (HRM)

1. Se realiza la qPCR con SYBR Green.
2. Se realiza la curva de fusión (melting). Se aumenta gradualmente la temperatura y se monitoriza la variación de la fluorescencia.

Interpretación de resultados de HRM:

• Curva de fusión: Representa la fluorescencia frente a la temperatura. Las variaciones en la secuencia producen cambios en la curva.
• Curva de picos de fusión: Derivada negativa de la curva de fusión. Los productos no deseados tienen puntos de fusión distintos.
• Detección de mutaciones:
  • Un único pico a la Tm del amplicón WT: ADN sin mutaciones.
  • Un único pico a una Tm diferente: Mutación en homocigosis.
  • Dos picos (uno a la Tm del WT y otro a la Tm del mutante): Mutación en heterocigosis.
• Curva de diferencias: Compara la curva de melting de una muestra problema con una de referencia.

qPCR con Sondas Específicas: Sondas TaqMan

Utiliza sondas (oligonucleótidos marcados con fluorocromos) que hibridan específicamente en la región central del amplicón.

Sondas de hidrólisis o TaqMan: Contienen un fluorocromo reportero (R) en el extremo 5′ y un quencher (Q) en el extremo 3′ (fosforilado para evitar la elongación). En las fases de desnaturalización e hibridación, R y Q están próximos, y no hay emisión de fluorescencia. En la fase de extensión, la polimerasa hidroliza la sonda (actividad exonucleasa 5′), separando R y Q, lo que permite la emisión de fluorescencia. La fluorescencia es proporcional a los amplicones formados.

Cuantificación Absoluta con Sonda TaqMan

Permite obtener un valor absoluto de la cantidad de secuencia diana en la muestra (µg/µl o número de copias). Se utiliza para cuantificar cargas virales. Se realiza una curva de calibración con patrones de concentración conocida. El software genera una recta de calibración (Ct frente a log(Concentración)). Se interpola el Ct de la muestra en la recta para calcular la concentración.

Cuantificación Relativa: Método ΔΔCt

Se utiliza para estudiar la expresión génica. Expresa la concentración de un gen diana en relación con la concentración de un gen de referencia (presente en todas las muestras en un número constante de copias). No requiere curva de calibración.

Pasos:

1. Calcular ΔCt₁: ΔCt₁ = Ct (gen diana muestra) – Ct (gen de referencia muestra).
2. Calcular ΔCt₂ en una muestra de referencia (ej. sano): ΔCt₂ = Ct (gen diana referencia) – Ct (gen de referencia referencia).
3. Calcular ΔΔCt: ΔΔCt = ΔCt₁ – ΔCt₂.
4. Calcular la expresión relativa: 2^-ΔΔCt.

Genotipado (Genotyping)

Utiliza dos sondas TaqMan marcadas con fluorocromos diferentes (FAM y VIC), complementarias a la secuencia diana excepto por un nucleótido. Permite estudios de SNP (polimorfismos de un solo nucleótido) o mutaciones frecuentes (HotSpot).

Se necesitan:

• Primers específicos para la secuencia diana.
• Sondas TaqMan: Una sonda Wildtype (VIC) y una sonda mutante (FAM).
• Reactivos para PCR.

Dependiendo de la secuencia diana, hibridará una sonda, la otra o ambas. Se observan curvas de amplificación de VIC (homocigoto WT), FAM (homocigoto mutante) o ambas (heterocigoto). Los resultados se muestran en una gráfica donde cada eje corresponde a la cantidad de alelo detectado.

Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

Conceptos Básicos

• Espécimen: Tejido, fluido, órgano o resto de un ser vivo que contiene material genético.
• Muestra: Parte del espécimen que se analiza (ADN o ARN).

Los ácidos nucleicos se pueden extraer de cualquier espécimen que contenga células. La primera etapa es procesar el espécimen y aislar el material genético. El procedimiento depende del tipo de espécimen.

Etapas del procesamiento:

1. Separación de las partes.
2. Disgregación del tejido.
3. Lisis celular e inactivación de las nucleasas intracelulares.

Procesamiento de Especímenes Específicos

• Sangre periférica: Consideraciones sobre el recuento celular, volumen de sangre y protocolo (diagnóstico vs. investigación).
• Buffy coat (fase plaqueto-leucocitaria): Método de elección para almacenar el espécimen congelado o para investigación.
• Rendimiento del espécimen: Cantidad máxima de ácido nucleico obtenible. Depende de factores como el tipo de espécimen, hipoxia, fijador, almacenamiento, método de procesado y extracción.
• Otros tipos de especímenes: Sangre seca, enjuagues bucales, fibroblastos fetales, células cultivadas, blastómeras, fluidos corporales, muestras forenses, especímenes de animales, plantas, hongos, etc.
• Líquidos «humanos»: Semen, orina, líquido cefalorraquídeo, etc.
• Células: Cultivo en suspensión y adhesión (tripsinización).
• Saliva: Incubación a 50°C para optimizar el rendimiento.
• Tejido fresco y congelado: Separación, fragmentación y homogenización.

Fragmentación o Disrupción Mecánica del Tejido

• TissueRuptor: Sondas autoclavables.
• Micronaja de mortero: Autoclavable, manual.
• TissueLyser: Perlas de acero inoxidable o cloruro de tungsteno.
• Sonicador de sonda: Aplica energía de sonido para romper membranas celulares (sonoporación).

Disrupción Química del Tejido

Utilización de un buffer de lisis con agentes caotrópicos (urea) que desestabilizan las moléculas e interfieren con los enlaces no covalentes.

Homogenización

Utilización de enzimas como la proteinasa K para romper enlaces proteicos y liberar los ácidos nucleicos. La proteinasa K también inactiva las RNasas y DNasas.

Es habitual utilizar inhibidores enzimáticos y trabajar en frío para minimizar la degradación enzimática.

Métodos de Extracción de Ácidos Nucleicos

La extracción separa, limpia y recupera los ácidos nucleicos. Puede ser necesaria una purificación posterior. El rendimiento de la extracción indica la cantidad de ácido nucleico obtenido por cada 100 unidades presentes en el espécimen.

Los métodos se clasifican según su principio de actuación y se seleccionan según:

• Alcance (tipo de espécimen).
• Rendimiento.
• Calidad (pureza, integridad, funcionalidad).

Principales métodos:

• Precipitación mediante sales y alcoholes (Salting-out).
• Extracción con solventes orgánicos.
• Adsorción en columna de sílice.
• Separación magnética.

Precipitación Mediante Sales y Alcoholes (Salting-Out)

Después de la lisis celular y la eliminación de proteínas, se precipitan los ácidos nucleicos con isopropanol o etanol. Permite obtener ADN de alta pureza. Se basa en la solubilidad diferencial del ADN.

Pasos generales:

1. Lisis celular.
2. Precipitación (degradación proteica con SDS y sales, precipitación del ADN con alcohol).
3. Lavado con alcohol frío al 70%.
4. Resuspensión en agua o buffer TE.

Ventajas:

• No necesita campana de extracción.
• Puede usarse para cualquier tipo de espécimen (excepto tejido FFPE).
• Económico.

Desventajas:

• Manual, rendimiento dependiente del operador.
• Necesita volúmenes de espécimen mayores.

Extracción con Solventes Orgánicos

El lisado celular se mezcla con fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. Las proteínas se extraen en la fase orgánica, y los ácidos nucleicos quedan en la fase acuosa.

Ventajas:

• Buen rendimiento, económico.

Desventajas:

• Reactivos tóxicos y volátiles (necesita campana).
• Manual, riesgo de contaminación, dependiente del operador, consume tiempo.
• Necesita ADN intacto.
• Necesaria purificación.

Extracción con Resina Chelex

También llamada técnica inorgánica. Chelex 100 es una resina de intercambio iónico para el proceso de extracción de ADN. Chelex 100 (Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.) Es un copolímero de estirenodivinilbenceno que contiene pares de iones iminodiacetato que actúan como grupos quelantes (secuestrando) iones de metales polivalentes. Chelex está clasificado como resina de intercambio catiónico débilmente ácida en virtud de sus grupos de ácido carboxílico. La capacidad de intercambio catiónico de la resina es funcional a un pH neutro o débilmente ácido (> 4,0) y se regenera eficazmente en ácido diluido. A pH muy bajo, la resina comienza a funcionar como intercambiador de aniones. Por lo tanto, Chelex se clasifica como un intercambiador de cationes débilmente ácido con alta afinidad por los iones metálicos divalentes. De esta forma inactiva Dnasas y otras enzimas responsables de inhibir la PCR o de degradar el ADN VENTAJAS: – Elimina eficientemente los productos de la lisis celular – Los reactivos no son tóxicos – Económica, sencilla y práctica – Puede usarse en muestras con alto contenido en sales DESVENTAJAS – Sólo puede aislarse ADN desnaturalizado de cadena sencilla: vale para PCR pero no para otras técnicas 

ADSORCIÓN EN COLUMNA DE SÍLICE Esta metodología se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos a membranas de sílice, en presencia de sales caotrópicas. En presencia de ciertas sales los AN quedan retenidos por adsorción en columnas de sílice. Posteriormente las columnas se lavan con soluciones salinas que eliminan las partículas que no se han unido y finalmente los ácidos nucleicos son eluídos con agua o una solución con una baja concentración de sales. Descubierta en 1979 por Bert Vogelstein, demostró que el ADN se unía al polvo de vidrio en presencia de yoduro sódico. Bajo condiciones nativas, los AN están recubiertos de una capa de agua que mantiene su solubilidad en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos, se destruye esta capa hidratante, creando un entorno hidrofóbico, lo cual permite que el ADN se una a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas y otros contaminantes no se unen y son eliminados durante los pasos de lavado. Esta sal cotrópica: – Desestabiliza las moleculas de agua. – Desnaturaliza las proteinas. – ↑la solubilidad de sustancias apolares. – Destruye las interacciones hidrofobicas. – Lisa las celulas e inactiva las nucleasas. Los AN se eluyen de la membrana utilizando buffer de elucion con ↓ [sales] (ligeramente alcalinos) o agua, que permiten recuperar la capa hidratante liberándolos de la membrana, sin afectarlos. VENTAJAS – Elimina eficientemente los productos de la lisis celular – Los reactivos no son tóxicos – Rápida, sencilla y práctica – Puede usarse en especímenes limitados – Se obtienen AN altamente purificados para ser usados en procesos posteriores como PCR, RTPCR, qPCR, secuenciacion, blotting, clonaje, etc. DESVENTAJAS – Es cara SEPARACIÓN MAGNÉTICA En este método las muestras lisadas se mezclan con esferas o perlas magnéticas con capacidad de unirse a los ácidos nucleicos. Mediante un separador magnético se realizan una serie de lavados para conseguir la máxima purificación del material genético. – Las perlas se añaden junto con una solución amortiguadora a pH ácido que permite cargar positivamente a las perlas, favoreciendo la unión de ADN – Para eluir el AN se utiliza una solución básica de Tris-HCl 10 mM a pH 8.5 para neutralizar la carga de las perlas VENTAJAS – Limpio, rápido – -Buen rendimiento – Automatizable→Muy utilizada por extractores automatizados. – Especímenes de un amplio rango de volúmenes. INCONVENIENTES – Fácilmente saturables – Los AN se eluyen en un buffer salino que puede interferir en algunas reacciones, por lo que puede ser necesario purificarlo posteriormente. – No discrimina bien entre DNA y RNA. – Caro 3. ANÁLISIS EN ELECTROFORESIS Agua de grado de biología molecular: agua desinfectada, esterilizada pasada por rayos ultravioletas para llegar hasta este grado Así, nos aseguramos de que nuestro espécimen no se destruya por las nucleasas presentes en el agua Una vez extraídos los ácidos nucleicos debe valorarse tanto la cantidad como la calidad del ácido nucleico obtenido La calidad de los ácidos nucleicos depende de: – La integridad de los AN, valorada por el tamaño de los fragmentos obtenidos – ¿se ha fragmentado el DNA/RNA? – La pureza de los AN obtenidos- se valora la posible presencia de contaminantes – La funcionalidad de los AN obtenidos: valora lo útil que es el AN para realizar el estudio genético. No podrá conocerse hasta que sea objeto del propio estudio, pero puede intuirse a través de su integridad y su pureza Se disponen de diferentes métodos para valorar cada uno de estos aspectos: Para valorar la integridad o la posible degradación de los AN se puede utilizar la electroforesis (aprovecha la carga de los ácidos nucleicos para separarlos) en geles de agarosa (se utilizan en biología molecular para crear la esponja por la que pasarán los especímenes de ADN o ARN). Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de ADN van a emigrar de diferente forma PASOS DE LA ELECTROFORESIS: – Gel de agarosa para la separación de moléculas de ADN o ARN – Cargar las muestras en los pocillos – Conectar la corriente eléctrica – Los fragmentos de ADN migran a través del gel de acuerdo con sus tamaños – Calle o carril de patrones – Patrones (tamaño en kb) – Se representa el tamaño de los patrones de ADN.

Para visualizar los ácidos nucleicos se debe utilizar bromuro de etidio, pero este reactivo es enormemente tóxico Interpretación ADN Si cargamos una muestra de ADN obtenido en un gel de agarosa al 0.8% p/v podemos observar: – Una banda única equivalente a unos 20 kb: hemos obtenido un material genético de la máxima calidad porque mantiene toda su longitud, podemos decir que el ADN está integro – Una colección de bandas de diferentes tamaños que nos indicará que el ADN está parcialmente degradado. Cada una de las bandas representa un tamaño de fragmento de ADN. En este caso, además, podemos valorar la causa de la degradación  Si se trata de un smear concentrado en la parte superior del gel que nos indicará que se trata de una degradación por envejecimiento del ADN  Si se trata de un smear concentrado en la parte inferior del gel nos indica que el ADN ha sido degradado por acción de las DNasas Interpretación ARN Si cargamos una muestra de ARN obtenido en un gel de agarosa al 1% p/v podremos observar: – Un smear en el que destacan 2 bandas correspondientes a los ARN de las unidades ribosómicas: 4 a 5 kb correspondiente a la subunidad de 28S y 1,9 Kb correspondiente a la subunidad de 18S ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS, PURIFICACIÓN Y ALMACENAJE CANTIDAD Y PUREZA DE LOS AN OBTENIDOS: ESPECTOFOTOMETRÍA El método básico para cuantificar la cantidad de ADN es la espectrofotometría Los ácidos nucleicos presentan una absorbancia (A) máxima a 260 nm por lo que midiendo la absorbancia a esta longitud de onda (λ) podemos estimar la cantidad de AN presente en la muestra. Como referencia podríamos decir que una A=1 a λ=260 nm se corresponde con una concentración de 50 µg/ml de dsDNA puro, 40 µg/ml de RNA o 30 µg/ml de DNA monocatenario (ssDNA). Para valorar la pureza (o la contaminación) de la muestra por proteínas y otros contaminantes como los solventes utilizados durante la extracción, las sales, carbohidratos, RNA… también se debe medir la absorbancia a: – 280 nm (a los que absorberán las proteínas y los solventes orgánicos) – 230 nm (a los que absorberán carbohidratos, sales y compuestos orgánicos) – 320 nm (sirve para corregir la turbidez). Una vez medidas dichas absorbancias se calcularán las siguientes ratios: • Ratio 260/280 → mide contaminación por fenoles y proteínas. – Si es menor de 1,6 debe purificarse. En el caso de contaminación por proteínas podría realizarse un tratamiento adicional de proteinasa K. Si la contaminación se debe a la presencia de fenoles podría realizarse tratamiento de lavado y precipitación. Sin embargo, para garantizar el éxito de la purificación se aconseja un kit específico de purificación. Como desconocemos si se trata de proteínas o de químicos se aconseja hacer las dos cosas. – Si se trata de DNA y la ratio es mayor de 2,1 indica la existencia de RNA en la muestra. Se incubrará 1 hora a 90ºC – Cómo regla general aceptaremos una ratio 260/280 de 1,8-2,1 para decir que el ADN está limpio y de 2-2,2 para decir que el ARN está limpio. • ➢ Ratio 260/230 → mide contaminación de carbohidratos y sales y debe estar entre 1,5 y 2,2. – Si es menor de 1,5 debe purificarse por precipitación alcohólica y lavados o con un kit de purificación. – Cómo regla general aceptaremos un ratio 260/230 de 1,8-2,0 para decir que el AN está limpio, pero la ratio ideal es de 2-2,2. – No obstante, hay que tener en cuenta que esta medida no aporta una información tan exacta como la relación A260/280 y que puede verse distorsionada por una baja concentración de ADN en la muestra puesto que se estaría sobrevalorando la concentración de sales presentes en el tampón de resuspensión. – Un ratio mayor de 2,2 también puede estar indicando contaminación por sales caotrópicas o compuestos orgánicos. – El EDTA y el etanol también pueden disminuir el ratio 260/230, usualmente por debajo de 0,5. Además, para corregir la absorbancia por otros contaminantes que provocan turbidez en la muestra, debe medirse la A a 320 nm y restarse a los valores de A a 230, a 280 y a 260 nm. La alternativa es realizar un blanco del control negativo de extracción para restar dicha turbidez al resultado de nuestra muestra.

El bioanalizador utiliza flúroforos que se intercalan con las moléculas de las bases nitrogenadas o entre la doble hélice. Conforme va calculando la cantidad de fluorescencia, va calculando la cantidad de ácido nucleico Para calcular estos tamaños, tendremos en cuenta la tabla proporcionada. En esta, nos darán las cantidades (medidas en pb) y el segundo en el que sale cada una de ellas Si nuestra muestra ha salido en el segundo 64, haremos una regla de 3 para calcular la concentración A continuación, lo haremos con el siguiente fragmento más parecido en tiempo, con el del segundo 66 por ejemplo, que mide 700pb 59 s-620 pb x: 672, 54 pb 64 s- xpb Hacemos una media entre las dos: 675,67: 676 pb (redondeamos para arriba) 66s-700pb x: 678.79 64s-xpb ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS: PURIFICACIÓN Y ALMACENAJE BIOANALIZADOR: Integridad y cantidad de los AN y sus fragmentos El bioanalizador es una plataforma basada en la tecnología de microfluidos diseñada para la determinación del tamaño, la cuantificación y el control de calidad de ADN, ARN y proteínas en un único instrumento, mediante electroforesis en pequeños chips. Los resultados se obtienen en un corto espacio de tiempo de forma automatizada, directamente en formato digital. La miniaturización de los instrumentos analíticos ofrece numerosas ventajas frente a las técnicas convencionales. Entre ellas, una mejor precisión y reproducibilidad de los datos, tiempos de análisis reducidos, un mínimo consumo de muestra o una mejor automatización e integración de flujos de trabajo complejos. – Chip con una capacidad de 12 muestras. – Necesaria concentración media de sales→ mejor AN resuspendidos en H2O-GBM – Existen diferentes chips dependiendo del tamaño de DNA que se quiera visualizar o del tipo de extracción de RNA (RNA total, RNA mensajero, RNA de pequeño tamaño). – También hay kits específicos para muestras de muy baja concentración. – La concentración de AN a analizar debe estar ajustada→ PRIMERO HAY QUE PASAR POR NANODROP, TAMBIÉN PARA EVALUAR LA PUREZA • DNA → 0.5-50 ng/μl El tamaño de los fragmentos a visualizar ha de estar comprendido dentro de los rangos de cada uno de los chips. • RNA total → 25-500 ng/μl. • mRNA → 25-250 ng/μl Los chips se deben preparar previamente a su utilización: – Se prepara el gel: se añaden los DYEs (los fluoróforos que se unirán a nuestros fragmentos) al gel siguiendo el protocolo del kit. – Se carga el gel en el CHIP en la “priming station”. Se trata de un sistema con una jeringa que al introducir aire a presión en la “G gorda” empuja el gel por el interior de los microtubos hasta rellenarlos por completo. Una vez preparado el CHIP tenemos que cargar las muestras: – En los pocillos destinados a las muestras hay que añadir: o 5 µl de marker→ lleva 2 conjuntos de moléculas del ácido nucleico del kit (DNA o RNA) de tamaño y concentración conocidos LOWER MARKER→ molécula del tamaño mínimo para el kit UPPER MARKER→ molécula del tamaño máximo para el kit Ambos están marcados con un fluoróforo específico, diferente al que se integra en el gel. El sistema los utiliza para calcular la concentración de nuestros fragmentos, además de para entender el inicio y el fin de la carrera de ese pocillo→ cuando el lower marker pasa por el lector el sistema comienza a registrar la muestra del pocillo que está activado y cuando el upper marker pasa por el lector el sistema entiende que la muestra del pocillo a terminado, se prepara para apagar el electrodo de ese pocillo y encender el electrodo del pocillo siguiente. – 1 µl de muestra – En los pocillos con una G hay que añadir más gel. – En el pocillo marcado con una escalerita hay que añadir 5 µl de marker y 1 µl del “Ladder” (el size standard que viene con el kit. – Finalmente se da vórtex al CHIP en el IKA vortex durante 1 minuto y se coloca en el Bioanalizador ELECTROFEROGRAMA DEL LADDER: Se utiliza para concretar los tamaños de cada fragmento de nuestras muestras por comparación. Para calcular estos tamaños, tendremos en cuenta la tabla proporcionada. En esta, nos darán las cantidades (medidas en pb) y el segundo en el que sale cada una de ellas Si nuestra muestra ha salido en el segundo 64, haremos una regla de 3 para calcular la concentración A continuación, lo haremos con el siguiente fragmento más parecido en tiempo, con el del segundo 59 por ejemplo, que mide 700pb 59 s-620 pb x: 672, 54 pb 64 s- xpb Hacemos una media entre las dos: 675,67: 676 pb (redondeamos para arriba) 66s-700pb x: 678.79 64s-xpb VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA Y EN BIOANALIZADOR DEL PRODUCTO DE LA MISMA PCR A PARTIR DE DIFERENTES CANTIDADES DE DNA UTILIZADO. El sistema nos da los datos tanto en forma de gel como en forma de electroferograma. Además, nos da una tabla con el tamaño de los fragmentos correspondientes a cada pico y su concentración en ng/µl. BIOANALIZADOR: MUESTRAS DE RNA Sólo se ven los picos correspondientes a las bandas de los RNA ribosómicos 28s y 18s, pues su concentración es tan alta que no permiten ver el resto de RNAs Sin las bandas de los RNA ribosómicos, podemos ver el resto de RNAs, que al ser de todos los tamaños posibles se observan como una montaña. Los mRNA están en torno a 200- 1000 pares de bases (ver eje X). ÍNDICES DE CALIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS EN EL BIOANALIZADOR DNA: Genomic Quality Number (GQN) GQN toma valores de 0-10. Los valores reflejan el porcentaje de ADN por encima del umbral definido según la técnica. Un GQN bajo ( 9) indica ADN no degradado de buena calidad

RNA: RNA Integrity Number (RIN) Tradicionalmente, la integridad del ARN viene dada por la ratio de las bandas del rARN 28S/18S: si es 2, se considera que el ARN es de buena calidad. Sin embargo, para estandarizar el proceso de interpretación de integridad del ARN, Agilent Technologies introdujo el número de integridad (RIN) en el algoritmo del Bioanalyzer, modificada con respecto a su habitual consideración. El valor o score de RIN que nos facilita el Bioanalyzer se basa en un algoritmo que tiene en cuenta los picos de las subunidades ribosómicas, pero corregido por el resto del perfil electroforético. Permite asignar un valor numérico objetivo a la calidad del ARN eucariota en una escala de 1 a 10, siendo 1 el perfil más degradado y 10 el más intacto. – RIN ≤ 4: baja calidad (habitual en muestras FFPE) – RIN 4-7: calidad media – RIN ≥ 7: buena calidad Actualmente, el RIN es un valor fundamental para la incorporación de muestras a las tecnologías más novedosas (como microarrays o NGS (secuenciación de nueva generación)). Sin embargo, aunque el RIN facilita la evaluación de la integridad del ARN y hace más fácil comparar muestras o métodos de extracción de ARN, no es posible determinar de antemano si el experimento funcionará o no. Por ejemplo, un RIN de 5 podría no funcionar para un experimento de microarrays pero sí para un experimento de qRTPCR. En general, muestras con RIN más altos de 8 deberían funcionar para la mayoría de los experimentos. Por lo tanto, según la técnica que queramos utilizar después, muestras con un RIN u otro podrán ser utilizadas con buenos resultados, por ejemplo: – RIN ≤ 4: baja calidad (habitual en muestras FFPE) → dará problemas en la mayoría de las técnicas – RIN 4-7: calidad media → OK para RT-qPCR – RIN ≥ 7: buena calidad → apropiadas para microarrays y NG

Etiquetas: amplificación de ADN, PCR, PCR convencional, PCR en tiempo real, qPCR