PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS

Estructura

Las proteínas son macromoléculas orgánicas formadas por la unión de más de cien aminoácidos unidos entre sí por medio de enlaces amida o enlaces peptídicos que se establecen entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro aminoácido. La secuencia lineal de aminoácidos de una proteína constituye su estructura primaria y es específica de cada proteína y, además, determina su función biológica. Las proteínas presentan una estructura tridimensional o espacial característica que permite que pueda llevar a cabo su función y que constituyen su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria.

Estructura primaria:

Viene determinada por la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica, es decir, cuántos aminoácidos hay y en qué orden están situados.

Estructura secundaria:

La cadena lineal de aminoácidos se pliega sobre sí misma originando estructuras tridimensionales como la estructura de α-hélice, la de lámina plegada β o una estructura flexible que puede cambiar al azar. Esta estructura secundaria está estabilizada mediante la formación de puentes de hidrógeno.

Estructura terciaria:

La estructura anterior puede, a su vez, plegarse sobre sí misma originando la estructura terciaria de las proteínas. Enlaces hidrofóbicos, fuerzas polares, puentes de hidrógeno e incluso enlaces covalentes van a estabilizar esta estructura.

Estructura cuaternaria:

Constituida por la asociación de varias cadenas polipeptídicas origina la estructura cuaternaria que se mantiene mediante fuerzas hidrofóbicas u otros tipos de enlaces como covalentes o electrostáticos. Estas cadenas pueden ser iguales como en la enzima hexoquinasa (dímero), análogas pero no exactamente iguales como en la hemoglobina formada por cuatro cadenas muy parecidas e iguales dos a dos (hemoglobina A formada por dos cadenas α y dos cadenas β) o diferentes como en el caso de enzimas complejos formados por péptidos con funciones diferentes.

Enlaces en las moléculas proteicas: En la estructura primaria de las proteínas, la unión entre los aminoácidos (enlaces peptídicos) se realiza mediante enlaces covalentes. En las estructuras secundaria y terciaria las uniones son más débiles y no covalentes, excepto en los puentes disulfuro; pueden ser:

• Iónicas o electrostáticas que unen iones positivos y negativos que se encuentren a poca distancia.
• Puentes de hidrógeno, más débiles que las anteriores y consisten en uniones electrostáticas que forman un tipo de puente entre dos átomos: el hidrógeno y otro fuertemente negativo como, por ejemplo, carbono, nitrógeno y oxígeno.
• Uniones producidas por la interacción de cadenas laterales no polares y por la mutua repulsión por el solvente.
• Fuerzas de Van der Waals que se establecen entre cadenas laterales polares.

Clasificación de las proteínas

Las proteínas pueden clasificarse de acuerdo a diversos criterios:

a) Según su forma tenemos:

• Proteínas fibrosas: están formadas por cadenas polipeptídicas dispuestas de forma paralela entre sí y unidas mediante puentes disulfuro, de hidrógeno… El colágeno y la queratina son ejemplos de este tipo de proteínas.
• Proteínas globulares: una o más cadenas de aminoácidos con una estructura α-hélice adoptan una forma esférica. Ejemplos de proteínas globulares los encontramos en muchas enzimas, hormonas y anticuerpos.

b) Según su composición las proteínas pueden ser:

• Simples: compuesta únicamente por aminoácidos.
• Conjugadas: formadas por un componente proteico -los aminoácidos- y otro no proteico o grupo prostético que puede ser orgánico o inorgánico -lípidos, glucosa, fósforo, ácidos nucleicos…- Las proteínas conjugadas, según la naturaleza de su grupo prostético, pueden ser glucoproteínas, lipoproteínas, nucleoproteínas, cromoproteínas, fosfoproteínas.

c) Según su localización podemos clasificar las proteínas en:

• Proteínas hísticas o proteínas situadas en los tejidos.
• Proteínas hemáticas, las localizadas en la sangre (hemoglobina, proteínas plasmáticas).

Digestión y metabolismo de las proteínas

La digestión de las proteínas se inicia en el estómago por la pepsina producida en las células principales de las glándulas gástricas en forma de pepsinógeno (precursor inactivo de la pepsina) y que es activado por el ácido clorhídrico del estómago. La pepsina divide las cadenas proteicas en unidades más pequeñas, polipéptidos.

En el intestino delgado, la tripsina y la quimiotripsina del jugo pancreático siguen descomponiendo las cadenas proteicas en otras de menor longitud y las peptidasas y aminopeptidasas del jugo intestinal nos permite obtener dipéptidos y aminoácidos respectivamente.

La absorción de las proteínas se realiza principalmente en forma de aminoácidos aunque polipéptidos pueden ser absorbidos a través de la mucosa intestinal siendo transportados al hígado a través de la vena porta.

Una vez los aminoácidos han llegado al hígado los aminoácidos pueden seguir tres caminos diferentes:

1. Ser utilizados en el hígado para la síntesis de proteínas estructurales o de otro tipo (albúmina, globulinas…)
2. Atravesar el hígado y dirigirse a otros tejidos donde pueden ser incorporados a proteínas estructurales o ser utilizados en la síntesis de productos (síntesis de enzimas …)
3. Sufrir el proceso de desaminación en el hígado.

La desaminación, como ya hemos visto, consiste en la eliminación de grupo amino de un aminoácido mediante un proceso de oxidación: el grupo amino se transforma en urea siendo transportada por la sangre hasta el riñón donde será excretada siendo el principal producto nitrogenado presente en la orina. El resto de la molécula del aminoácido puede ser oxidada para obtener energía en el ciclo de Krebs, convertida en hidratos de carbono o en grasas. Tanto, la urea es un producto nitrogenado residual procedente del metabolismo de los aminoácidos que es eliminada de la sangre a través de la orina.

PROTEÍNAS SÉRICAS

Las proteínas plasmáticas constituyen el 8 % de los solutos del plasma siendo su concentración de 6-8.5 g/dl. Aunque constituyen una pequeña parte de las proteínas totales del organismo, su accesibilidad y la relación que mantienen con todos los tejidos y órganos del cuerpo le confieren una gran importancia en el laboratorio clínico.

Funciones de las proteínas plasmáticas

• Origen de aminoácidos para los tejidos; existe un equilibrio entre los aminoácidos circulantes en el plasma y las proteínas tisulares. Si disminuyen los aminoácidos se liberan las proteínas celulares y si disminuyen las proteínas celulares, se sintetizan nuevas a partir de los aminoácidos circulantes.
• Mantenimiento de la presión osmótica (sobre todo la albúmina).
• Actúan como amortiguador fisiológico.
• Transporte de sustancias en el organismo (fármacos, hormonas, bilirrubina, lípidos…).
• Defensiva (gammaglobulinas).
• Otras: coagulación (fibrinógeno), enzimas.

Tipos de proteínas plasmáticas

La técnica más importante en el estudio de proteínas plasmáticas es la electroforesis que permite la separación de sus distintas fracciones al ser sometidas a la acción de un campo eléctrico según su tamaño, carga eléctrica y forma. Mediante la electroforesis de suero se obtienen las siguientes fracciones:

a) Prealbúmina:

Baja desnutrición, procesos inflamatorios y hepatopatías.

b) Albúmina:

Valores normales 3,5-5,2 g/l, el 52-68 % del total. Baja en hepatopatías crónicas, síndrome de malabsorción, desnutrición, neoplasias, enfermedades renales. Alta en deshidratación (hemoconcentración).

c) Globulinas:

Está formado por un conjunto heterogéneo de proteínas y proteínas conjugadas (glucoproteínas, lipoproteínas). Mediante electroforesis podemos diferenciar tres grupos:

α – globulinas:

Corresponden a este grupo el 15 % del total de proteínas plasmáticas siendo sus valores normales 0,3-0,7 g/dl.

• α1-globulinas
  • α1-antitripsina: Su función es inhibir la acción de la tripsina. Baja enfisema pulmonar, cirrosis hepática. Alta Reacciones inflamatorias agudas.
  • α1-lipoproteínas: Transportan colesterol (HDL). Alta Hiperlipemias bajaEnfermedades hepáticas
  • Transcobalamina: Transporta la vitamina B12 baja Malnutrición
  • Protrombina: Es precursor de la trombina. Baja Hepatopatías, tratamiento con dicumarínicos.
• α2-globulinas
  • Ceruloplasmina: Proteína transportadora de cobre. Baja Enfermedad de Wilson
  • Haptoglobina: Proteína transportadora de hemoglobina. Alta Inflamación aguda y crónica baja Hepatopatías, algunas anemias.
  • α2-lipoproteínas: Transporta lípidos (VLDL). Alta Hiperlipidemias bajaInsuficiencia hepática.
  • Eritropoyetina: Estimula la producción de eritrocitos. Alta Algunos tipos de anemia bajaNefropatías (insuficiencia renal crónica).

β – globulinas:

Representan el 12 % de las proteínas plasmáticas siendo sus valores normales entre 0,4 y 0.8 g/dl.

• Transferrina:Transporta hierro. Alta Anemias ferropénicas. Baja Hepatopatías y neoplasias.
• β-lipoproteína: Transporta colesterol y fosfolípidos (LDL). Alta.Hiperlipidemias, síndrome nefrótico. Baja Desnutrición.
• C3 y C4: Forman parte del sistema complemento.
• Hemopexina: Transporta el grupo Hem.

γ – globulinas:

Sus valores normales son 0,6-1,1 g/dl. Corresponde a la banda ancha de la electroforesis y corresponde a los anticuerpos. Pueden ser Ig A, Ig D, Ig M, Ig E, Ig G. Alta Procesos inflamatorios (infecciones) y en enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso). Baja Hipogammaglobulinemia, inmunosupresión.

El fibrinógeno es una proteína plasmática que no aparece en la electroforesis si la muestra utilizada es suero, si se utiliza plasma migra entre la curva de las beta y las gamma. Es precursor de la fibrina, por lo tanto, participa en el proceso de la coagulación siendo sus valores normales 2-3 g/dl. Su concentración aumenta en procesos inflamatorios agudos, embarazo o uso de anticonceptivos orales y, disminuye en hepatopatías y en la coagulación intravascular diseminada.

Alteraciones de las proteínas plasmáticas

La estrecha relación que se establece entre la sangre con los tejidos y órganos del cuerpo, condiciona la frecuente aparición de alteraciones en la composición y función de los componentes proteicos del plasma. En general podemos clasificarlos en:

Disproteinemias:

Alteración de alguna de las bandas de la electroforesis.

• 1.1. Hiperglobulinemias.
  • 1.1.1. Púrpura hipergammaglobulinémica: Afecta principalmente a mujeres y se caracteriza por un aumento policlonal de las IgG y cursa con brotes recidivantes de lesiones purpúricas en la parte interior de las piernas.
  • 1.1.2. Crioglobulinemia: Caracterizada por la presencia de inmunoglobulinas que precipitan cuando la temperatura del plasma disminuye, lo cual sucede al circular por la piel y tejido celular subcutáneo de las extremidades. En el laboratorio las crioglobulinas se determinan después de coagular la sangre a 37ºC, incubando el suero separado a 4º C durante 24 horas y examinando su gelificación o precipitación.
• 1.2. Hipoalbuminemia.
  • 1.2.1. Por defecto en la síntesis de albúmina:
    • Insuficiencia hepática
    • Malnutrición.
  • 1.2.2. Por aumento de su eliminación:
    • A través de la piel: en quemaduras o dermatitis graves
    • A través del aparato gastrointestinal: enteropatía pierdeproteínas.
    • A través del riñón: síndrome nefrótico.
• 1.3. Hipogammaglobulinemia.

  En inmunodeficiencias en las que predominan defectos en los linfocitos B o células plasmáticas como por ejemplo:

  • Agammaglobulinemia ligada al cromosoma X.
  • Déficit de IgA.
  • Hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia …

  Igualmente, las situaciones contempladas en hipoalbuminemias por aumento de eliminación coexisten con hipogammaglobulinemias.

Paraproteinemias:

Presencia de inmunoglobulinas o de fragmentos de inmunoglobulinas anormales en el plasma. Su aparición se debe a la proliferación de un clon de linfocitos B (gammapatías monoclonales) pero SIN la presencia de un estímulo antigénico previo.

• Mieloma múltiple: tumor de células plasmáticas en la médula ósea con sobreproducción de una inmunoglobulina monoclonal (IgG,IgA, IgD o IgE) o de proteína de Bence Jones (cadenas ligeras κ o λ monoclonales libres)
• Hiperviscosidad de la sangre: Por incremento de las IgM (macroglulinemia de Waldenström)
• Enfermedades de las cadenas pesadas: discrasias de células plasmáticas que se caracteriza por la sobreproducción de cadenas pesadas de inmunoglobulinas monoclonales: enfermedad de la cadena pesada IgA (producción excesiva de la cadena cadena α), enfermedad de la cadena pesada IgG (afecta a la cadena pesada γ), enfermedad de la cadena pesada IgM (afecta a la cadena pesada μ).

Alteraciones de la proteinemia total:

El incremento de todas las fracciones proteicas se debe a hemoconcentración. Exceptuando esta situación, la hiperproteinemia se produce por el incremento de la fracción de las gammaglobulinas. Las situaciones de hipoproteinemia se deben a disminuciones en la fracción de la albúmina y /o de las gammaglobulinas.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

PROTEÍNAS TOTALES

1 Métodos que no implican modificación química de las proteínas:

Mediante refractometría medimos, en la escala correspondiente, el índice de refracción del suero determinando las proteínas totales con bastante exactitud sobre todo si el suero es claro. Si el suero es hiperlipémico o presenta hemólisis los resultados pueden no ser exactos.

2 Métodos que implican modificación química:

2.1 Método de Kjeldahl:

Se basa en la determinación del nitrógeno proteico. Es el método más antiguo y muy exacto pero actualmente ha sido sustituido por otros métodos más rápidos y precisos.

2.2 Método de Biuret:

Es un método de referencia por la alta especificidad para las proteínas del reactivo de Biuret debido a la reproducibilidad de los resultados y la escasez de interferencias con otros componentes de la muestra.

Fundamento: Las proteínas séricas en presencia de sales de cobre (Cu²⁺) y en medio alcalino forman un complejo coloreado medible fotocolorimetricamente.

2.3 Absorción en el ultravioleta

Los enlaces peptídicos de las proteínas presentan absorción en el ultravioleta que puede medirse a 260 nm de longitud de onda. Esta técnica presenta exactitud, sensibilidad y precisión.

DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA

El método de fijación de colorantes es el más utilizado. Se fundamenta en la fijación de ciertos colorantes como el verde de bromocresol (VBC) y el ácido 2-(4-hidroxiazobenceno) benzoico (HABA), de forma más o menos específica a la albúmina y no con el resto de las proteínas plasmáticas.

MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

Entre las técnicas utilizadas para separar proteínas encontramos:

1. Filtración en gel:

   Se fundamenta en el tamaño de las partículas. Consiste en disolver la muestra problema en una solución tampón adecuada y, posteriormente, depositar la solución problema sobre una columna empaquetada de material inerte. Se deja fluir por gravedad y, de esta forma, las partículas menores penetran en los poros de las partículas inertes, mientras que no lo hacen las de mayor tamaño. De esta forma separamos las proteínas de mayor tamaño de las pequeñas.

2. Cromatografía de intercambio iónico.
3. Ultracentrifugación:

   Separa las proteínas en función del peso molecular.

4. Electroforesis:

   Las proteínas se separan a través de un disolvente mediante la acción de un campo eléctrico en función de su carga eléctrica. Debido a que las proteínas se comportan como ácidos o como bases dependiendo del pH del medio, migran al polo positivo (ánodo) o negativo (cátodo) de un campo eléctrico según la carga que posean. La velocidad del movimiento de cada proteína estará determinada por su carga y tamaño.

   En muchas ocasiones el trazado electroforético global obtenido mediante densitometría después de la separación de las distintas fracciones proteicas ofrece más información que las concentraciones numéricas. Los patrones electroforéticos más característicos son:

   • a. Patrón inflamatorio agudo (infecciones agudas o lesión hística): Se aprecia ligera disminución de la albúmina y aumento de las fracciones α1α2.
   • b. Patrón inflamatorio crónico: disminución significativa de la albúmina y aumento de las fracciones α1α2 y γ.
   • c. Trazado hipoproteinémico: Hay una disminución de todas las fracciones excepto la α1 y α2 que pueden aparecer normales o ligeramente aumentadas.
   • d. Patrón nefrótico: Hay una disminución de la albúmina, α1, γ e incremento de las α2.
   • e. Patrón hepático severo: α1α2 y β aparecen disminuidas y la fracción γ aumentada. Se produce la unión de la curva de las beta con la curva de las gamma, es el puente beta-gamma típico de la cirrosis hepática.
   • f. Hipergammaglobulinemia: disminución de la albúmina e incremento de las gamma.
   • g. Patrón monoclonal: Se aprecia la punta M correspondiente a la gammaglobulina que se produce en exceso.
5. Inmunoelectroforesis:

   Permite obtener mayores niveles de sensibilidad y especificidad. Combina la separación electroforética con reacciones inmunológicas entre las proteínas y anticuerpos específicos frente a ellas. Se aprecian arcos de precipitación correspondientes a las distintas fracciones proteicas.

6. Inmunodifusión radial:

   Se sitúa el suero en un pocillo localizado en una placa de agar impregnada de anticuerpos específicos frente a la proteína que se desea valorar.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS URINARIAS

La determinación de proteínas urinarias permite la valoración del estado funcional del riñón. Es más compleja que en el suero debido a que las proteínas urinarias se encuentran en baja concentración (100-200 mg/l), frecuentemente hay variaciones importantes en la composición de las proteínas urinarias en muestras distintas, a la presencia de sustancias no proteicas capaces de interferir los resultados y por la elevada concentración de iones. El análisis de proteínas totales en orina se puede realizar utilizando los siguientes métodos:

Métodos turbidimétricos

Tricloroacético (TCA):

Muy utilizados debido a su exactitud, precisión y sencillez. Se fundamenta en la medición mediante el espectrofotómetro (450-620 nm de longitud de onda) de la turbidez producida por la presencia de proteínas en presencia del ácido tricloroacético.

Ácido sulfosalicílico:

Muy sensible pero se prefiere el anterior debido a que produce más turbidez con la albúmina que con las gammaglobulinas.

Métodos químicos

Método de Biuret:

Presenta poca sensibilidad y está sujeto a interferencias. Para la determinación de proteínas urinarias totales actualmente se utiliza el método de Biuret modificado en el que inicialmente se concentran las proteínas de la muestra mediante la precipitación con tricloroacético y posterior centrifugación. Se fundamenta en la formación de un complejo violeta en presencia de sales de cobre en medio alcalino.

Métodos de fijación de colorantes

Los colorantes más utilizados son el azul brillante de Coomasie y el Rojo Ponceau (menos). Muy utilizado y es un método rápido. El fundamento del método, cuando se utiliza el azul brillante, se basa en que la fijación del colorante a los radicales NH₃⁺ de las proteínas produce un desplazamiento en la longitud de onda óptima de lectura de la absorción de 465 nm a 595 nm. El cambio de la absorbancia a esta última longitud de onda permite determinar la cantidad de proteínas presentes en la muestra.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES EN LCR

Las proteínas en LCR se encuentran en niveles muy inferiores al suero, entre 15 y 45 mg/dl y es fundamentalmente la albúmina debido a su bajo peso molecular que le permite el paso a través de la barrera hematoencefálica. Su determinación permite valorar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica que aumenta en estados patológicos y por ello incrementando la cantidad de proteínas en el LCR. Los métodos de determinación utilizados son:

1. Turbidimétricos
2. Método de Biuret
3. Método de Lowry
4. Métodos de fijación de colorantes

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