Introducción a la Espectrofotometría y Fotometría

La espectrofotometría se basa en la medida de la energía radiante emitida, absorbida, transmitida, dispersada y reflejada por un preparado de laboratorio cuando sobre él incide la citada energía.

La energía radiante se obtiene a partir de una fuente luminosa o calorífica (una lámpara, llama o reacción química). Estas técnicas se agrupan bajo la denominación de fotometría.

Métodos Fotométricos

Engloba los siguientes métodos:

• Fotometría de absorción molecular (visible y ultravioleta)
• Fotometría de luminiscencia (emisión de luz o fluorometría y quimioluminiscencia)
• Fotometría de dispersión (turbidimetría y nefelometría)
• Fotometría de emisión de llama
• Fotometría de absorción atómica
• Fotometría de reflexión

Interacción Radiación-Muestra

Las técnicas espectrométricas se basan en cómo interactúa la radiación con la muestra:

• Transmisión: Se produce cuando la radiación incide sobre la sustancia y no se produce pérdida de energía ni cambio de dirección.
• Absorción: Se produce cuando existe una pérdida de intensidad de la radiación al atravesar la sustancia. Las moléculas o partículas que absorben la radiación ganan energía y pasan a un estado excitado.
• Emisión: Se produce cuando las moléculas o átomos en estado excitado liberan su energía y vuelven a su estado de reposo.
• Dispersión: Se produce cuando la radiación choca contra una partícula en suspensión y cambia de dirección sin variar su energía.
• Refracción: El haz de radiación, al atravesar la solución, se desvía o cambia de dirección por la diferente naturaleza del medio de propagación.
• Reflexión: El haz de luz incide sobre una superficie y se produce un efecto de rebote y cambio de dirección.
• Difracción: El haz de luz se desvía al pasar por el extremo de una superficie o al atravesar una rendija.

Todas las técnicas fotométricas tienen su fundamento en las interacciones de las radiaciones electromagnéticas (REM).

Radiaciones Electromagnéticas (REM)

La REM es una forma de energía radiante que tiene propiedades ondulatorias.

• Longitud de onda (λ): Es la distancia existente entre dos picos consecutivos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se mide en nanómetros (nm).
• Frecuencia (ν): Es el número de ciclos completos por unidad de tiempo. Es inversa a la longitud de onda. La frecuencia se expresa en ciclos por segundo o hercios (Hz). Un hercio es igual a un ciclo por segundo.
• Energía (E): La energía de un fotón cualquiera viene definida por su frecuencia (E = hν, donde h es la constante de Planck). Las longitudes de onda más cortas poseen mayor energía que las longitudes de onda más largas.

Espectro Electromagnético (EEM)

Se denomina espectro electromagnético al conjunto de REM que existe en nuestro entorno. Dicho espectro incluye desde rayos gamma hasta ondas de radio. Este espectro se ha dividido en varias regiones en función de las longitudes de onda que lo componen:

• Rayos gamma
• Rayos X
• Ultravioleta (UV)
• Visible (Vis)
• Infrarrojo (IR)
• Microondas
• Ondas de radio

Región Visible del Espectro

La región visible del espectro es la zona de longitudes de onda a cuya energía responde el ojo humano. Está formada a su vez por las siguientes subregiones:

• Violeta: 340 a 425 nm
• Azul: 425 a 490 nm
• Verde: 490 a 575 nm
• Amarillo: 575 a 585 nm
• Naranja: 585 a 650 nm
• Rojo: 650 a 700 nm

La luz blanca es la suma de todas las radiaciones correspondientes a la zona visible del espectro.

Espectrofotometría de Absorción Molecular

Definición

Es un método que mide la concentración de un analito basándose en la capacidad de dicho analito para absorber luz de una determinada longitud de onda al ser excitado por una REM (radiación electromagnética).

Cuando este haz de luz incide sobre la muestra problema, esta absorbe radiación de una determinada longitud de onda. El resto de las radiaciones serán transmitidas y aparecerá a la vista un color que es la suma de las longitudes de onda que no han sido absorbidas; a este color se le llama color complementario.

La luz ultravioleta (UV) y la infrarroja (IR) también sufren el fenómeno de absorción, pero al no encontrarse dentro de la zona visible del espectro, el resultado no es un color complementario captable por el ojo humano.

El Proceso de Absorción

Existen moléculas o partes de moléculas que, al interaccionar con la radiación electromagnética, absorben parte de su energía y experimentan saltos en sus electrones desde unas órbitas a otras más alejadas del núcleo (excitación). A estas moléculas se les denominan especies absorbentes, cromóforos o cromógenos. En el proceso de absorción de una REM, se generaría un color si la absorción ocurre en el espectro visible.

Cuando una partícula de estas características se encuentra en estado de reposo e interacciona con el haz de luz, absorbe la energía y pasa a un estado excitado. La partícula en estado excitado tiende a regresar a su estado de reposo desprendiendo la energía absorbida en forma de calor.

Cada especie absorbente (cromóforo o cromógeno) tiene lo que se llama un espectro de absorción característico. Este espectro representa la relación existente entre la longitud de onda de la REM y la absorción que presenta la disolución problema que contiene el cromógeno.

Los espectros de absorción son de utilidad tanto para seleccionar la longitud de onda más adecuada para una medida fotométrica (determinación cuantitativa) como para fines de identificación de una sustancia (determinación cualitativa).

Transmitancia y Absorbancia

Cuando un haz de luz incide sobre una cubeta que contiene una solución capaz de absorber luz de una determinada longitud de onda, el haz de luz resultante tendrá una intensidad menor de salida que la que tenía de entrada. A la relación existente entre la intensidad de luz incidente (I₀) y la de la luz resultante o transmitida (I) se le define como transmitancia (T = I / I₀).

Dicha transmitancia tiende a expresarse en porcentaje (%T = T * 100), variando sus valores entre 0% y 100%, en función de que la solución absorba toda la luz incidente (T=0) o no absorba nada en absoluto (T=1).

En los fotómetros que se utilizan actualmente, las lecturas de %T pueden ser transformadas en absorbancia (A) y presentadas así al operador. La absorbancia se define como A = -log(T) = log(1/T) = log(I₀/I). Hay que tener en cuenta que la absorbancia en sí misma no es una cantidad medible directamente, sino que se obtiene por cálculo matemático a partir de la transmitancia medida por el sistema fotométrico.

Si se representa gráficamente en un eje de coordenadas la relación existente entre la transmitancia y la concentración del analito medido, se obtiene una curva que muestra una relación inversa (cuando aumenta la concentración, disminuye la transmitancia). Por el contrario, la relación entre absorbancia y concentración suele ser lineal en un rango determinado.

Ley de Lambert-Beer

Esta ley relaciona el grado de absorción de la disolución con la concentración del absorbente (el analito) y la longitud del trayecto que el haz de luz recorre a través de la disolución.

Matemáticamente se expresa como: A = ε · l · c

• A: Absorbancia (adimensional)
• ε: Coeficiente de absortividad molar (o coeficiente de extinción molar), característico de cada sustancia a una λ, pH y Tª dadas (L·mol⁻¹·cm⁻¹)
• l: Longitud del paso óptico de la cubeta (cm)
• c: Concentración del analito (mol·L⁻¹)

El coeficiente de absortividad (ε) es característico de cada sustancia. Dicho coeficiente es constante para cada sustancia si se fijan las condiciones de longitud de onda, pH y temperatura. Si el coeficiente es alto, el método analítico detectará concentraciones menores de la sustancia buscada, lo que aumentará la sensibilidad.

La ley de Lambert-Beer tiene una aplicación práctica y nos permite determinar métodos a partir de los cuales averiguamos la concentración de una sustancia de interés en una disolución. Basándonos en la relación lineal existente entre la absorbancia y la concentración, podremos conocer esta última de dos formas:

1. Por comparación con una disolución de parámetros conocidos (también llamada patrón o estándar).
2. Por transposición a una curva de calibración, que es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la absorbancia frente a la concentración para varias disoluciones patrón de concentración conocida.

Debemos conocer un parámetro denominado linealidad, que es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal concentración-absorbancia. Cuando la concentración del cromógeno en la disolución sobrepasa los límites de la linealidad, la ley de Lambert-Beer deja de cumplirse. También hay que tener en cuenta que si la concentración está fuera de los límites de linealidad (por dilución excesiva o insuficiente), tampoco se cumplirá esta ley.

Limitaciones de la Ley de Lambert-Beer

Existen una serie de circunstancias en las que la ley de Lambert-Beer no se cumple. Estas son:

• Cuando se miden concentraciones muy elevadas de cromógeno (interacciones intermoleculares, cambios en el índice de refracción).
• Cuando la radiación incidente no es monocromática (la ley es estrictamente válida para una única longitud de onda).
• Cuando existe luz errática o dispersa dentro del instrumento.
• Cuando los lados de la cubeta no son perfectamente paralelos o la cubeta no está limpia.
• Cuando existen interferencias por otros cromógenos presentes en la muestra que absorben a la misma longitud de onda.
• Cuando el cromógeno emite fluorescencia a la longitud de onda de medida.
• Cuando la absorbancia del solvente es significativa respecto a la del soluto.
• Reacciones químicas o equilibrios dependientes de la concentración (asociación, disociación).

El Espectrofotómetro

Es el instrumento que se utiliza para las medidas de absorción de las REM.

Tipos de Aparatos

Existen distintos tipos de aparatos para la medida de la absorción según el sistema selector de longitud de onda que utilicen:

• Colorímetro o Fotómetro: Emplean filtros (de vidrio o de interferencia) y obtienen luz aproximadamente monocromática en longitudes de onda discretas (a saltos).
• Espectrofotómetro: Emplean monocromadores (prismas o redes de difracción) y obtienen luz monocromática en un intervalo continuo de longitudes de onda.

La diferencia principal es que el espectrofotómetro permite seleccionar cualquier longitud de onda dentro de un rango continuo, mientras que el fotómetro o colorímetro solo permite trabajar en las longitudes de onda que proporcionan sus filtros.

Componentes de un Espectrofotómetro

Constan de:

• Fuente estable de energía radiante
• Rejillas de entrada y salida
• Selector de longitud de onda (monocromador o filtro)
• Compartimento y cubetas para la muestra
• Detector de energía radiante
• Sistema de lectura o medidor de datos

Fuente de Energía Radiante

Es el emisor de radiación electromagnética. Emite una banda amplia de radiaciones continuas alrededor de la longitud de onda deseada. Según la zona del espectro que se quiera utilizar, hay tres tipos principales:

• Visible (Vis): La más utilizada para las medidas en la región visible del espectro es la lámpara de tungsteno o tungsteno-halógena. También se pueden utilizar fuentes de luz LED o láser en algunos instrumentos.
• Ultravioleta (UV): Para las medidas en la región ultravioleta se utilizan lámparas de descarga de deuterio (D₂) o xenón (Xe).
• Infrarrojo (IR): Se utilizan fuentes especiales como el filamento de Nernst (óxidos de tierras raras) o el Globar (carburo de silicio).

Rejillas (Rendijas)

La rejilla de entrada pretende reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema selector de longitud de onda. La rejilla de salida tiene como función controlar el ancho de banda espectral que llega a la cubeta y evitar que la luz difusa la atraviese. Ambas intentan conseguir un haz de luz lo más paralelo y definido posible. En el caso de que la fuente de luz fuese láser (muy colimada y monocromática), no se necesitarían o serían diferentes.

Sistema Selector de Longitud de Onda

Selecciona la longitud de onda deseada del espectro emitido por la fuente. Se puede realizar por medio de filtros o monocromadores.

• Filtros: Son los sistemas más simples. Están formados por materiales que dejan pasar de forma selectiva las longitudes de onda deseadas, absorbiendo o reflejando el resto. Suelen ser de vidrio coloreado (banda ancha) o de interferencia (banda más estrecha).
• Monocromadores: Dispersan la luz policromática en sus diferentes longitudes de onda y permiten seleccionar una banda estrecha. Pueden ser:
  • Prismas: Normalmente de vidrio (para visible) o cuarzo (para UV), que descomponen la luz por refracción.
  • Redes de difracción: Placas metálicas o de vidrio con un gran número de surcos paralelos muy finos que descomponen la luz por difracción. Son más comunes en espectrofotómetros modernos.

La calidad de la monocromaticidad se mide por el ancho de banda espectral (intervalo de longitudes de onda que deja pasar el selector):

• Filtros de vidrio: ~50 nm
• Filtros de interferencia: 5-10 nm
• Prismas: 0.5-1.5 nm
• Redes de difracción: < 0.5 nm
• Láser: < 0.1 nm (no necesitaría selector)

Cubetas

Son los recipientes donde se colocan las soluciones para las medidas de absorbancia. Suelen ser cuadradas o rectangulares (con un paso óptico estándar de 1 cm) o redondas. Se construyen en diferentes materiales según el rango de λ:

• Vidrio: Útiles para medidas en el visible (aprox. 340-1000 nm).
• Plástico (poliestireno, acrílico): Útiles en el visible (aprox. 380-800 nm), son desechables.
• Cuarzo o Sílice fundida: Necesarias para lecturas en la región ultravioleta (por debajo de 340 nm, hasta aprox. 190 nm).

Las más utilizadas en clínica tienen un paso óptico de 1 cm.

Detectores de Energía Radiante

Son sistemas que convierten la energía luminosa que les llega (fotones) en una señal eléctrica (corriente de electrones) proporcional a la intensidad de la luz.

• Células fotovoltaicas o de barrera: Generan una corriente al ser iluminadas. Simples y baratas, pero menos sensibles y con efecto fatiga.
• Fototubos: Emiten electrones desde un cátodo fotosensible que son colectados en un ánodo.
• Tubos fotomultiplicadores (PMT): Muy sensibles. Los electrones emitidos por el fotocátodo son multiplicados en una serie de dínodos, generando una señal eléctrica amplificada. No tienen efecto fatiga significativo. Son comunes en espectrofotómetros de alta gama.
• Fotodiodos y Arrays de Fotodiodos (PDA): Semiconductores que generan corriente al ser iluminados. Los arrays permiten medir simultáneamente en múltiples longitudes de onda.

Medidores de Datos

La señal eléctrica generada por el detector se procesa y se lleva hasta un dispositivo de lectura (analógico o digital) que refleja su valor numéricamente (en %T, A, o concentración directamente si está calibrado).

Manejo del Fotómetro de Absorción

Los pasos generales son:

1. Conectar el aparato a la red y encender la lámpara. Es necesario un tiempo de calentamiento para estabilizar la fuente de luz.
2. Seleccionar la longitud de onda deseada.
3. Realizar un blanco: Medir la absorbancia de una cubeta con el disolvente o los reactivos sin el analito. Sirve para eliminar interferencias de la matriz y ajustar la lectura a 0 de absorbancia (o 100% de transmitancia).
4. Medir la absorbancia (o %T) de los patrones (si se usan) y de las muestras problema.
5. Calcular la concentración de las muestras.
6. Al finalizar, apagar la lámpara y desenchufar el aparato (o seguir las instrucciones del fabricante).

Si la medición espectrofotométrica se hace con luz ultravioleta (recordamos que no es visible), no podemos basarla en la absorción por una solución coloreada, sino en otro principio. Existen sustancias incoloras como el NAD⁺ o el NADP⁺ que no absorben significativamente a 340 nm, pero sus formas reducidas, NADH y NADPH, sí tienen un máximo de absorción a esa longitud de onda. Si hacemos participar al analito buscado en una reacción química acoplada en la que se produzca el paso de NAD⁺/NADP⁺ a NADH/NADPH, se producirá un aumento de absorbancia a 340 nm proporcional a la concentración del analito. Si, por el contrario, utilizamos una reacción química donde se consuma NADH/NADPH (paso a NAD⁺/NADP⁺), la absorbancia a 340 nm experimentará una disminución directamente relacionada con la concentración del analito. Esto es muy usado en enzimología clínica.

Tipos de Medidas Espectrofotométricas

Existen tres grandes variantes a la hora de realizar una medida con el espectrofotómetro:

Medidas a Punto Final

Tras poner en contacto patrón (si aplica) y muestra con los reactivos correspondientes y esperar a que tenga lugar completamente la formación del cromógeno (o el cambio de absorbancia), se procede a hacer una única lectura de absorbancia. El valor obtenido se transforma en concentración utilizando un factor de calibración (obtenido del patrón) o interpolando en una curva de calibración.

Ejemplo: Patrón/Muestra + Reactivo → Color (Absorción medida al final)

Medidas a Dos Puntos (o de Tiempo Fijo)

Supone la realización de dos medidas de absorbancia (A₁ y A₂) separadas por un intervalo determinado de tiempo (Δt). Dichas medidas se hacen sobre la muestra y sobre el estándar (si se usa). La diferencia de absorbancia (ΔA = A₂ – A₁) es proporcional a la concentración o actividad del analito. Este método puede ayudar a corregir algunas interferencias iniciales.

Se mide la interferencia inicial y luego el cambio.

Medidas Cinéticas (o de Velocidad de Reacción)

Se utilizan especialmente en determinaciones de actividad enzimática, a menudo con luz ultravioleta (midiendo el cambio de NADH/NADPH). En ellas se mide la variación de la absorbancia en la solución problema conforme va teniendo lugar la reacción química catalizada por la enzima. Se toman múltiples medidas (p. ej., 4 o 5) a intervalos de tiempo constantes (p. ej., cada 20 o 60 segundos) durante la fase lineal de la reacción. Se calcula la velocidad de cambio de absorbancia por unidad de tiempo (ΔA/Δt), usualmente como la media de las diferencias entre lecturas consecutivas. La multiplicación de este valor (ΔA/min) por un factor determinado (que incluye ε, l, volúmenes, etc.) da directamente la actividad enzimática (concentración de actividad) del analito. A menudo no se necesita blanco de reactivo ni patrón, aunque sí controles.

Interferencias en las Determinaciones Espectrofotométricas

Pueden existir sustancias en la muestra o en los reactivos que interfieran con la medida (absorbiendo a la λ de trabajo, causando turbidez, etc.). La corrección puede hacerse por eliminación previa del producto indeseado, pero existen otros métodos:

• Utilización de un blanco adecuado:
  • Blanco de reactivo: Contiene todos los componentes excepto la muestra. Corrige la absorbancia de los reactivos.
  • Blanco de muestra: Contiene la muestra y todos los componentes excepto uno esencial para la reacción de color. Corrige el color o turbidez propios de la muestra.
• Métodos bicromáticos: Medir la absorbancia a la longitud de onda principal (λ₁) y a una secundaria (λ₂) donde el analito absorbe poco pero la interferencia sí. La diferencia (A₁ – A₂) corrige la interferencia.
• Métodos cinéticos: Como miden un cambio en el tiempo, a menudo eliminan el efecto de interferencias iniciales constantes.

Otras Técnicas Espectrofotométricas y Relacionadas

Espectrofotometría de Absorción Molecular Infrarroja (IR)

La absorción molecular de radiaciones de esta zona del espectro (IR) produce transiciones en los niveles de energía vibracional y rotacional de las moléculas. Las bandas de absorción son muy estrechas y corresponden a enlaces químicos muy específicos (grupos funcionales) y a menudo dependen de los átomos más próximos. Un espectro infrarrojo es como una «huella dactilar» de la molécula, lo que implica que es una técnica idónea para identificar compuestos orgánicos o inorgánicos puros (análisis cualitativo) y determinar su estructura, pero no es tan adecuada para cuantificar en mezclas complejas como las muestras biológicas.

Los instrumentos más utilizados son los espectrofotómetros IR (dispersivos o, más comúnmente hoy en día, por transformada de Fourier – FTIR).

Espectrofotometría de Luminiscencia

Es un conjunto de técnicas espectroscópicas de emisión molecular, muchísimo más sensibles que las técnicas de absorción.

La emisión de luz se produce por acción de un agente externo que excita las moléculas del material problema. Dicha excitación hace que absorban la energía procedente de ese agente externo y experimenten saltos orbitales en sus electrones, alcanzando un estado excitado. Cuando las moléculas se liberan del exceso de energía, emiten un fotón de luz. A este fenómeno se le llama luminiscencia, y en él no existe pérdida ni ganancia neta de calor (es una «luz fría»).

Tipos de luminiscencia según el origen de la excitación:

• Fotoluminiscencia: Excitación por absorción de fotones (luz).
  • Fluorescencia: Emisión rápida tras la excitación.
  • Fosforescencia: Emisión más lenta tras la excitación.
• Quimioluminiscencia: Excitación por la energía liberada en una reacción química.
  • Bioluminiscencia: Quimioluminiscencia en sistemas biológicos (ej. luciferina/luciferasa).
• Electroluminiscencia: Excitación por un campo eléctrico.

Fotometría de Fotoluminiscencia o Fluorometría

Es un método que mide la concentración de un analito en una muestra basándose en la capacidad de dicho analito para emitir luz fluorescente al ser excitado por una REM luminosa.

Proceso de Emisión Fluorescente

Determinados compuestos químicos (fluoróforos) tienen la propiedad de que, tras ser excitados por una REM (luz de excitación) y experimentar los saltos electrónicos, son capaces de retornar a su estado de reposo emitiendo parte de esa energía en forma de luz (luz de emisión). La luz emitida por el compuesto tiene una longitud de onda mayor (y por tanto, una energía menor) que la luz de excitación absorbida (desplazamiento de Stokes).

El fenómeno de emisión fluorescente es más lento que el de absorción, pero aún así muy rápido (nanosegundos).

La intensidad de la luz fluorescente emitida se puede utilizar para cuantificar la concentración del compuesto que la emite, ya que, a bajas concentraciones, dicha intensidad es directamente proporcional a la concentración del fluoróforo y a la intensidad de la luz de excitación (análogo a la Ley de Lambert-Beer). Para conseguir esta relación directa, debemos trabajar con soluciones problema muy diluidas para evitar efectos de autoabsorción o «quenching».

El Fluorímetro

Para la medición de la fluorescencia se emplean fluorímetros (usan filtros para seleccionar λ de excitación y emisión) o espectrofluorímetros (usan monocromadores).

Poseen los siguientes componentes básicos:

• Fuente de energía radiante (intensa, ej. lámpara de arco de xenón)
• Selector de longitud de onda de excitación (filtro o monocromador)
• Rendijas de excitación (entrada)
• Compartimento y cubeta para la muestra
• Selector de longitud de onda de emisión (filtro o monocromador)
• Rendijas de emisión (salida)
• Detector de energía radiante (sensible, ej. PMT)
• Medidor

Una diferencia clave con el espectrofotómetro de absorción es la geometría: el detector (junto con el selector de emisión y la rendija de salida) se coloca formando un ángulo de 90 grados con respecto a la dirección del haz de excitación que atraviesa la cubeta. Esto se hace para minimizar la detección de la luz de excitación transmitida y medir únicamente la luz fluorescente emitida por la muestra en todas direcciones.

La fuente de energía radiante suele ser una lámpara de arco de xenón, que emite luz de alta intensidad en un espectro amplio (UV-Vis, aprox. 200-600 nm).

Las rendijas son similares a las de los espectrofotómetros. Los selectores de longitud de onda son dos: uno tras la fuente (selector de excitación) para elegir la λ que será absorbida en mayor medida por el analito, y otro antes del detector (selector de emisión) para elegir la λ a la que emite el analito y eliminar fluorescencias parasitarias o luz dispersada.

Las cubetas son generalmente de sílice o cuarzo para permitir el paso de luz UV.

La ventaja más importante de la fluorometría es su enorme sensibilidad (capacidad para detectar pequeñas cantidades de analito), que puede llegar a ser entre 100 y 1000 veces superior a la de la espectrofotometría de absorción.

Aplicaciones de la Fluorometría

Se aplica normalmente a sustancias que se encuentran en la muestra en muy pequeña cantidad, debido a la alta sensibilidad del método, como pueden ser hormonas, vitaminas, enzimas, fármacos, drogas, contaminantes, etc. Actualmente, una aplicación muy extendida de la fluorometría se basa en su asociación a reacciones inmunoquímicas (inmunofluorescencia, fluoroimmunoensayo – FIA).

Fotometría de Quimioluminiscencia

Es un método que mide la concentración de un analito en la muestra basándose en la capacidad de dicho analito (o de una molécula marcadora asociada a él) para emitir luz al ser excitado por la energía procedente de una reacción química específica.

La emisión de luz tiene lugar cuando una molécula emite un fotón como resultado de su participación en una reacción química, mediante la cual es llevada a un estado excitado y retorna a su estado de reposo emitiendo luz. Esta emisión se realiza sin pérdida ni ganancia neta de calor. El instrumento necesario (luminómetro) es más simple que un fluorímetro, ya que no requiere fuente de luz externa ni selector de excitación, solo un compartimento para la reacción, un detector sensible (PMT) y un medidor.

La electro quimioluminiscencia (ECL) es una variante que se emplea actualmente, donde el estado excitado es generado electroquímicamente en la superficie de un electrodo. Estas técnicas son extremadamente sensibles y se usan mucho en inmunoensayos (inmunoquimioluminiscencia – CLIA, ECLIA).

Fotometría de Emisión Atómica (Fotometría de Llama)

Es un método que mide la concentración de un analito (generalmente un metal) en una muestra basándose en la capacidad de dicho analito para emitir luz de una determinada longitud de onda característica al ser sus átomos excitados térmicamente en una llama.

Es utilizada clásicamente para determinaciones de iones de metales alcalinos (Grupo 1) y alcalinotérreos (Grupo 2) en líquidos biológicos, especialmente sodio (Na), potasio (K) y litio (Li). En la actualidad, se están sustituyendo en muchos laboratorios por técnicas de electrodo ion-selectivo (ISE), que son más sencillas.

Fotómetro de Llama

Se basa en el fenómeno de emisión atómica. La lámpara de un fotómetro se sustituye por una llama que actúa como fuente de excitación y sistema de atomización. No existe cubeta para la muestra líquida, que es aspirada directamente a la llama.

Los elementos que constituyen este aparato son:

• Sistema de introducción de muestra: Aspirador-Nebulizador (convierte la muestra líquida en aerosol) y, a veces, Diluidor.
• Fuente de atomización y excitación: Quemador y Gases (combustible como propano, butano o acetileno + comburente como aire u oxígeno).
• Componentes ópticos: Selector de longitud de onda (filtro de interferencia específico para cada elemento), Rendijas.
• Detector de energía radiante (fototubo o PMT).
• Medidor de datos.

El aspirador-nebulizador convierte la muestra líquida en finas gotas (aerosol). A veces se incluye un diluidor para disminuir la viscosidad (especialmente en muestras como suero) y ajustar la concentración al rango lineal. El quemador es la parte donde el aerosol de la muestra es introducido en la llama. La alta temperatura de la llama evapora el disolvente, disocia las sales y excita térmicamente los átomos del metal.

Los componentes fotométricos (rendijas, selector de longitud de onda, detector, medidor) son similares a los de otros fotómetros, pero los selectores suelen ser filtros de interferencia muy específicos para las líneas de emisión características de Na, K o Li.

Fotometría de Llama Directa y con Estándar Interno

Pueden ser de dos tipos:

• Directa: Se emplea directamente la intensidad de la luz emitida por el analito como medida de su concentración, comparándola con patrones. Es sensible a fluctuaciones en la llama o la nebulización.
• Con Estándar Interno: La intensidad de emisión luminosa del analito se compara con la de un elemento agregado a la muestra y a los patrones en concentración constante (el estándar interno, ej. Cesio o Litio si no se mide Li). Este método compensa variaciones en las condiciones de la llama o la aspiración. Los fotómetros de llama utilizados en clínica suelen ser de este tipo.

Fotometría de Absorción Atómica (AAS)

Es un método que mide la concentración de un analito (generalmente un metal) en una muestra basándose en la capacidad de los átomos de dicho analito en estado fundamental para absorber luz de una longitud de onda muy específica, que es la misma que emitirían si estuviesen excitados.

Esta técnica es muy utilizada para determinaciones de muchos metales (más de 60 elementos), incluyendo algunos importantes en clínica como calcio (Ca), magnesio (Mg), cobre (Cu), zinc (Zn), plomo (Pb), hierro (Fe), etc., en líquidos biológicos y otras muestras.

Está basada en el fenómeno de absorción de luz por átomos libres. El elemento a estudiar es introducido en un atomizador (llama o horno de grafito) donde es disociado de sus enlaces químicos y llevado a estado de vapor atómico, mayoritariamente en estado fundamental (no excitado ni ionizado). En estas condiciones, la nube de átomos es capaz de absorber la luz emitida por una fuente de radiación electromagnética específica para ese elemento (una lámpara construida con el mismo metal a medir), que emite precisamente las líneas del espectro características de este elemento.

El sistema fotométrico mide la cantidad de luz de esa línea específica que es absorbida por la nube atómica. Mide la atenuación (disminución de la intensidad) de la luz incidente a su paso por la nube atómica, como consecuencia de las interacciones de los fotones con los átomos en estado fundamental. Según la Ley de Lambert-Beer, a medida que el número de átomos en estado fundamental del elemento a medir en la nube atómica se incrementa, también lo hace la cantidad de luz absorbida (absorbancia), y esto permite conocer la concentración del analito en la muestra original.

El Fotómetro de Absorción Atómica

Los elementos constituyentes de un espectrofotómetro de absorción atómica son:

• Fuente de luz específica: Lámpara de Cátodo Hueco (HCL) o Lámpara de Descarga sin Electrodos (EDL) para el elemento a medir.
• Sistema de introducción de muestra: Nebulizador (para llama) o inyector (para horno).
• Atomizador: Quemador con llama (aire-acetileno, N₂O-acetileno) u Horno de Grafito (ETAAS).
• Componentes ópticos: Monocromador (generalmente de red de difracción de alta resolución) para aislar la línea espectral de interés, Rendijas.
• Detector (generalmente PMT).
• Sistema de lectura y procesamiento de datos.

La lámpara de cátodo hueco (HCL) es la fuente de luz más común. Está diseñada para emitir las líneas del espectro atómico características de un elemento dado. Por ello, se utilizan lámparas específicas según el elemento a medir. Consiste en una cápsula de vidrio sellada que contiene un gas inerte a baja presión (neón o argón) y dos electrodos: un ánodo y un cátodo cilíndrico hueco fabricado (o recubierto) del mismo metal que se quiere medir. Cuando se aplica un alto voltaje entre los electrodos, el gas se ioniza y los iones positivos bombardean el cátodo, arrancando átomos del metal (sputtering). Estos átomos metálicos en fase gaseosa son excitados por colisiones y emiten luz con las longitudes de onda características del elemento del cátodo.

Los gases utilizados para la llama son similares a los de emisión de llama (ej. acetileno + aire para metales fáciles de atomizar; acetileno + óxido nitroso para metales refractarios).

El aspirador-nebulizador tiene funciones parecidas al del fotómetro de llama.

El quemador (atomizador de llama) o el horno de grafito (atomizador electrotérmico) tienen como función transformar la muestra (líquida o sólida) en una nube de átomos libres en estado fundamental. La llama lo hace mediante calor, mientras que el horno de grafito es un tubo de grafito calentado eléctricamente por el que pasa la luz, ofreciendo mayor sensibilidad y menor volumen de muestra.

Los componentes fotométricos (rendijas, selector de longitud de onda, detector, medidor) son similares a los de un espectrofotómetro UV-Vis, pero con particularidades. El monocromador debe ser de alta resolución (tipo red de difracción) para aislar la estrecha línea de absorción atómica de otras líneas cercanas emitidas por la lámpara o la llama. Los detectores empleados suelen ser fotomultiplicadores (PMT) por su sensibilidad.

La variante con horno de grafito (ETAAS o GFAAS) reemplaza la llama para conseguir la nube de átomos. Aporta mayor sensibilidad (permite detectar concentraciones mucho menores) y requiere menos muestra, siendo útil para la determinación de metales pesados (como plomo, cadmio) y otros elementos traza.

Espectrofotometría de Dispersión (Turbidimetría y Nefelometría)

Son métodos que miden la concentración de un analito en una muestra basándose en la capacidad de las partículas de dicho analito (o de un precipitado formado por él) en suspensión para dispersar el paso de un rayo de luz incidente.

Fenómeno de la Dispersión (Scattering)

Este fenómeno se produce al colisionar una radiación (generalmente monocromática y visible) con una suspensión de partículas. La interacción induce en cada partícula una oscilación de sus electrones sin que afecte a los niveles energéticos internos (no hay absorción neta). Como consecuencia, las partículas se convierten a su vez en una nueva fuente de energía que emite (dispersa) radiación en todas las direcciones del espacio. Esta radiación emitida por la partícula se denomina luz dispersa y es, en su mayor parte (dispersión elástica o de Rayleigh/Mie), de la misma longitud de onda que la radiación incidente.

Los fenómenos de dispersión de luz dependen de los siguientes factores:

• Concentración de las partículas dispersantes.
• Tamaño y forma de las partículas.
• Peso molecular (si son macromoléculas).
• Longitud de onda de la luz incidente.
• Ángulo de observación (distancia y ángulo del detector respecto a la cubeta y al haz incidente).

En función del tamaño de la partícula en relación a la longitud de onda, la luz incidente experimenta diversos patrones de dispersión (Rayleigh para partículas pequeñas, Mie para partículas más grandes), lo que determinará el tipo de medida a realizar (nefelometría o turbidimetría).

La intensidad de la luz dispersada es, bajo ciertas condiciones (baja concentración), directamente proporcional a la concentración de las partículas en la solución problema.

Medición de la Luz Dispersa: Turbidimetría y Nefelometría

Puede hacerse mediante dos métodos analíticos diferentes:

• Turbidimetría: Se utiliza para suspensiones formadas por partículas relativamente grandes y/o concentradas. Consiste en la medida de la disminución de la intensidad de un haz de luz incidente cuando pasa a través de la suspensión (similar a una medida de absorbancia). El detector se coloca a 180° respecto a la fuente (en línea con el haz incidente). Mide la luz transmitida (I), y la turbidez se relaciona con -log(I/I₀).
• Nefelometría: Se utiliza para suspensiones formadas por partículas de menor tamaño y/o más diluidas, especialmente para medir inmunoprecipitados (complejos antígeno-anticuerpo). Consiste en la medida de la intensidad de la luz dispersada por la suspensión. Dicha medida se realiza en ángulos distintos al de incidencia (generalmente entre 15° y 90°). Es más sensible que la turbidimetría para bajas concentraciones.

Turbidímetro / Nefelómetro

Independientemente de que midamos la disminución de la transmitancia (turbidimetría) o la intensidad de la luz dispersada (nefelometría), el instrumento utilizado (turbidímetro o nefelómetro) se compone de elementos similares a un fotómetro, aunque dispuestos de forma diferente en el caso de la nefelometría:

• Fuente de energía radiante (lámpara de tungsteno, LED, láser)
• Sistema óptico (lentes, rendijas) para colimar el haz
• Selector de longitud de onda (filtro o monocromador, no siempre necesario si se usa láser o LED)
• Compartimento y cubeta para la muestra
• Detector de energía radiante
• Medidor de datos

La fuente de energía radiante puede ser una lámpara de tungsteno, mercurio, xenón, un LED o un láser. Esta última es a menudo preferida por generar haces de luz intensos, estables y de longitud de onda precisa.

Las rejillas y lentes ayudan a conseguir que el haz de luz que incide en la muestra sea paralelo y definido.

El selector de longitud de onda puede ser un filtro o un monocromador, aunque a veces no es estrictamente necesario si la fuente es monocromática (láser) o si se mide la turbidez total.

Las cubetas son similares a las de espectrofotometría.

El detector y su posición son la clave de la diferencia: en turbidimetría, se sitúa a 180° (como en absorción); en nefelometría, se sitúa en un ángulo diferente, comúnmente 90°, pero pueden usarse otros ángulos (nefelometría de ángulo variable o de ángulo frontal).

Interferencias

Tanto en los reactivos como en la muestra (especialmente suero o plasma) pueden existir partículas que produzcan una dispersión de luz no deseada (turbidez basal). Es el caso de las lipoproteínas (sueros lipémicos), quilomicrones, etc. Podemos intentar solucionar el problema usando un blanco de muestra, centrifugando a alta velocidad, usando agentes clarificantes, o trabajando con longitudes de onda donde la interferencia sea menor.

Técnicas Analíticas Relacionadas

Espectroscopía de Masas (MS)

Es una técnica analítica muy potente que permite estudiar compuestos de naturaleza diversa y obtener información tanto cualitativa como cuantitativa. Es posible mediante esta técnica obtener información de la masa molecular del compuesto analizado, así como obtener información estructural del mismo (a través de la fragmentación) o podemos detectar su presencia y cuantificar su concentración (a menudo acoplada a técnicas de separación como GC o LC).

Se basa en ionizar las moléculas de la muestra en fase gaseosa, separar estos iones según su relación masa/carga (m/z) utilizando campos eléctricos y/o magnéticos, y detectarlos. Al final se obtiene una gráfica llamada espectro de masas, que representa la abundancia relativa de los iones detectados en función de su relación m/z.

Refractometría

Mide el índice de refracción de una solución. La refracción es el fenómeno de desvío que experimenta un haz de luz al pasar de un medio a otro con diferente densidad óptica (ej. del aire a una solución). El ángulo de desvío se denomina ángulo de refracción.

Se conoce como índice de refracción (n) de una solución a la relación entre la velocidad de la luz en el vacío (o aire) y la velocidad de la luz a su paso por esa solución. Su valor depende de la temperatura, la longitud de onda de la luz y, crucialmente, de la concentración de las sustancias disueltas en la misma. Se puede calcular la concentración total de solutos en una solución midiendo su índice de refracción con un aparato llamado refractómetro. Se usa, por ejemplo, para medir la concentración de proteínas totales en suero o la densidad específica de la orina.

Fotometría de Reflectancia (Química Seca)

Esta técnica está basada en la reflexión de la luz, la cual se produce cuando un haz de luz incide sobre una superficie y cambia de dirección, rebotando en el mismo medio. Los analizadores que utilizan este método determinan la concentración de un determinado analito basándose en la medida de la luz reflejada por una zona reactiva.

Se conoce comúnmente como química seca porque se emplean soportes (tiras reactivas, portaobjetos multicapa) que contienen los reactivos necesarios en estado seco. Tras el contacto con la muestra (una gota de sangre, suero, orina), los reactivos se disuelven y se da una reacción química que produce un cambio de color en la superficie de la tira. La intensidad de este color, medida por la cantidad de luz reflejada a una o varias longitudes de onda (reflectancia), puede ser transformada en la concentración del analito mediante una calibración previa. Es la base de muchos analizadores portátiles y de punto de atención (POCT).

Osmolalidad y Propiedades Coligativas

La osmolalidad es una medida de la concentración total de partículas de soluto osmóticamente activas en una solución, expresada en osmoles (o miliosmoles) por kilogramo de solvente (mOsm/kg).

Los solutos disueltos modifican cuatro propiedades físicas de las soluciones llamadas propiedades coligativas, que dependen del número total de partículas de soluto presentes, no de su naturaleza química:

1. Descenso de la presión de vapor
2. Aumento del punto de ebullición
3. Descenso del punto de congelación
4. Presión osmótica

Cuando aumenta la osmolalidad de una solución, se produce un descenso del punto de congelación y un descenso de la presión de vapor (y un aumento del punto de ebullición y de la presión osmótica) proporcionales al número de partículas disueltas. Se puede determinar la osmolalidad de una solución (como suero u orina) midiendo una de estas propiedades mediante un aparato llamado osmómetro. Los dos tipos más comunes en clínica son:

• Osmómetro de punto de congelación: Mide el descenso crioscópico. Es el método de referencia.
• Osmómetro de presión de vapor: Mide el descenso de la presión de vapor.

Técnicas de Separación: Cromatografía

Entendemos por técnicas de separación aquellas que permiten aislar o separar los componentes de una mezcla. La cromatografía es un conjunto de técnicas de separación de solutos basadas en las diferentes afinidades que muestran dichas sustancias por dos fases inmiscibles entre sí: una fase móvil (líquido o gas) que fluye a través de una fase estacionaria (sólido o líquido fijado a un soporte sólido).

Al aplicar esta técnica, la fase móvil arrastra la mezcla a separar a través de la fase estacionaria. Aquellos componentes que tengan más afinidad por la fase estacionaria se retrasarán en su avance, mientras que los componentes que tengan poca afinidad por la fase estacionaria (y más por la móvil) la atravesarán rápidamente. De esta manera, cada uno de los componentes progresa a lo largo de la fase estacionaria con una velocidad distinta, logrando su separación en una serie de bandas o zonas.

Clasificación de la Cromatografía

Se clasifican según distintos criterios:

• Según las características físicas de la fase móvil:
  • Cromatografía Líquida (LC): La fase móvil es un líquido.
  • Cromatografía de Gases (GC): La fase móvil es un gas.
  • Cromatografía de Fluidos Supercríticos (SFC): La fase móvil es un fluido supercrítico.
• Según el mecanismo físico-químico de separación (interacción soluto-fase estacionaria):
  • Cromatografía de Adsorción: Separación basada en la adsorción reversible de los solutos sobre la superficie de una fase estacionaria sólida.
  • Cromatografía de Partición (o Reparto): Separación basada en la diferente solubilidad (distribución) de los solutos entre la fase móvil líquida y una fase estacionaria líquida inmiscible con la móvil (fijada a un soporte sólido).
  • Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC): Separación de solutos iónicos basada en su interacción electrostática reversible con grupos cargados fijos en la fase estacionaria (resina de intercambio iónico).
  • Cromatografía de Exclusión Molecular (o Filtración en Gel o SEC): Separación basada en el tamaño molecular de los solutos. Las moléculas más grandes eluyen primero porque no pueden penetrar los poros de la fase estacionaria.
  • Cromatografía de Afinidad: Separación basada en una interacción biológica específica y reversible entre el soluto y un ligando inmovilizado en la fase estacionaria (ej. antígeno-anticuerpo, enzima-sustrato).
• Según la forma física del lecho cromatográfico (aparataje):
  • Cromatografía en Soporte Plano: La fase estacionaria forma una capa delgada sobre un soporte plano.
    • Cromatografía en Papel (PC)
    • Cromatografía en Capa Fina (TLC)
  • Cromatografía en Columna: La fase estacionaria se empaqueta dentro de un tubo (columna). Es la forma más común para análisis cuantitativos (LC, GC, etc.).

Mecanismos de Separación

Adsorción

Se utiliza en cromatografía líquido-sólido (LSC) y gas-sólido (GSC), tanto en soportes planos como en columnas. Se basa en el establecimiento de interacciones reversibles (electrostáticas, puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals) entre los solutos y la superficie activa de la fase estacionaria sólida. Estas interacciones permiten que los solutos se fijen (adsorban) temporalmente en la superficie de la fase estacionaria.

La fase estacionaria puede estar constituida por adsorbentes polares (como sílica gel -ácida- o alúmina -básica-) o no polares (como carbón activado o polímeros). La fase móvil (líquida o gaseosa) compite con los solutos por los sitios activos de la fase estacionaria. La fuerza de elución de la fase móvil depende de su polaridad relativa a la de la fase estacionaria.

Partición o Reparto

Se utiliza en cromatografía líquido-líquido (LLC) y gas-líquido (GLC), en soportes planos y, sobre todo, en columnas. Es una técnica basada en la separación de solutos por su diferente solubilidad (coeficiente de partición o reparto) entre una fase móvil (líquida o gas) y una fase estacionaria líquida inmiscible con la móvil, que está soportada sobre un sólido inerte.

Podemos distinguir dos grandes modos según la polaridad relativa de las fases:

• Cromatografía de Partición en Fase Normal (NP-LC): La fase estacionaria líquida es polar (ej. agua o glicol sobre sílice) y la fase móvil es apolar (ej. hexano, cloroformo). En esta modalidad, los componentes más polares de la mezcla son retenidos con más intensidad por la fase estacionaria, mientras que los apolares eluyen rápidamente.
• Cromatografía de Partición en Fase Reversa (o Invertida) (RP-LC): Es la modalidad más utilizada en LC. La fase estacionaria es apolar (ej. cadenas hidrocarbonadas C8 o C18 químicamente unidas a sílice) y la fase móvil es polar (ej. mezclas de agua o buffer con metanol o acetonitrilo). En este caso, los componentes apolares son retenidos con más intensidad que los polares. Los componentes más polares eluyen primero.

Intercambio Iónico (IEC)

Se utiliza en cromatografía líquido-sólido y se realiza típicamente en columnas dentro de las cuales va empaquetada la fase estacionaria, que es una resina de intercambio iónico (un polímero sólido con grupos funcionales cargados unidos covalentemente).

El fundamento de la separación de solutos iónicos (o ionizables) es de tipo electrostático. Hay interacciones reversibles entre los solutos cargados en la fase móvil y los grupos cargados de signo opuesto fijos en la resina. La elución se consigue cambiando el pH o la fuerza iónica (concentración de sal) de la fase móvil para desplazar los solutos retenidos.

Las resinas de intercambio iónico pueden ser:

• Catiónicas: Tienen grupos cargados negativamente (ej. -SO₃⁻, -COO⁻) e intercambian cationes (iones positivos) de la muestra.
• Aniónicas: Tienen grupos cargados positivamente (ej. -NR₃⁺) e intercambian aniones (iones negativos) de la muestra.

Esta técnica se utiliza para la separación de iones inorgánicos (ej. purificación de aguas) y biomoléculas cargadas como aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos.

Exclusión Molecular (SEC)

También llamada cromatografía de filtración en gel (GFC) si la fase móvil es acuosa, o cromatografía de permeación en gel (GPC) si es orgánica. Se utiliza en cromatografía líquido-sólido sobre columnas en cuyo interior está dispuesto un gel poroso (fase estacionaria) formado por un material inerte (polímero entrecruzado como dextrano, agarosa, poliacrilamida) que presenta poros de un tamaño controlado.

El fundamento de la separación es la diferencia en el tamaño molecular (radio hidrodinámico) de las sustancias a separar. Las moléculas más grandes que el límite de exclusión del gel no pueden entrar en los poros y atraviesan la columna rápidamente, eluyendo primero. Las moléculas más pequeñas pueden penetrar en los poros en mayor o menor medida según su tamaño, por lo que recorren un camino más largo y quedan retenidas, eluyendo más tarde. Cuanto menor sea el tamaño molecular, mayor retención experimenta la sustancia.

Las aplicaciones de esta técnica se orientan a la separación de macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos), la determinación de pesos moleculares y la desalación o cambio de buffer de muestras biológicas.

Afinidad

Se utiliza en cromatografía líquido-sólido sobre columnas en las que existe una fase estacionaria constituida por un soporte sólido inerte sobre el que se ha inmovilizado covalentemente una sustancia (ligando) que muestra una afinidad biológica específica y reversible por el soluto de interés (analito).

Esta técnica de separación se basa en mecanismos de reconocimiento molecular muy selectivos, como las interacciones enzima-sustrato (o inhibidor), hormona-receptor, antígeno-anticuerpo, lectina-carbohidrato, etc.

Cuando la fase móvil (que contiene la mezcla) atraviesa la columna, solo las sustancias con afinidad específica por el ligando quedarán retenidas, pasando las demás. Los elementos retenidos pueden ser liberados (eluidos) luego cambiando las condiciones de la fase móvil (pH, fuerza iónica, adición de un competidor) para debilitar o romper la interacción específica ligando-analito. Es una técnica muy potente para purificar biomoléculas.

Tipos de Cromatografía (Según Aparataje)

Cromatografía en Soporte Plano

Se realiza de dos formas distintas: sobre papel y en capa fina.

Cromatografía en Papel (PC)

El soporte sobre el que se coloca la fase estacionaria tiene forma plana y consiste básicamente en un papel de celulosa de elevada pureza. La fase móvil en la que irá disuelta la muestra es un líquido (generalmente mezcla de solventes orgánicos y agua). La fase estacionaria también es de naturaleza líquida (agua adsorbida por la celulosa), por lo que la cromatografía en papel es del tipo líquido-líquido (partición). La separación se basa en la diferente partición de los solutos entre la fase móvil y el agua estacionaria.

El resultado final es una serie de manchas (spots) consecutivas separadas entre sí a lo largo del papel. Algunas veces estas manchas no son visibles, por lo que es necesario revelarlas con reactivos específicos (colorantes).

Se puede detectar y cuantificar las sustancias separadas utilizando técnicas de elución: recortamos los trozos de papel correspondientes a cada mancha, los introducimos en recipientes con un disolvente adecuado para extraer el componente, y el líquido coloreado resultante se mide por fotometría de absorción. Es una técnica principalmente cualitativa o semicuantitativa.

Cromatografía en Capa Fina (TLC)

El soporte utilizado también es plano (una lámina de vidrio, plástico o aluminio) sobre el cual se deposita una capa muy fina y uniforme de partículas adsorbentes (fase estacionaria sólida, por ejemplo, gel de sílice, alúmina, celulosa). La fase móvil es un líquido (o mezcla de disolventes) adecuado a las sustancias a separar, que asciende por capilaridad por la capa fina.

El mecanismo de separación más común es la adsorción (líquido-sólido), aunque también pueden usarse fases estacionarias modificadas para partición. La detección puede hacerse visualmente si los compuestos son coloreados, utilizando luz UV si absorben UV (con placas que llevan un indicador fluorescente), o mediante revelado con reactivos químicos que producen color o fluorescencia.

La cuantificación puede basarse en métodos de elución (raspando la zona de la placa y extrayendo el compuesto) o, más modernamente, mediante métodos fotodensitométricos in situ, que requieren un aparato llamado densitómetro o escáner de TLC que mide la absorbancia o fluorescencia de las manchas directamente sobre la placa.

Cromatografía en Columna

Es la forma más utilizada para análisis cuantitativos y preparativos. La fase estacionaria se empaqueta dentro de un tubo (columna). La fase móvil (líquida o gaseosa) se hace pasar a través de la columna.

Las columnas con las que se trabajan estas cromatografías están formadas por un tubo de longitud y diámetro variables, que llevan empaquetado en su interior un soporte sólido. Dicho soporte puede comportarse directamente como fase estacionaria (sólida, ej. sílice en adsorción, resina en intercambio iónico, gel en exclusión) o estar recubierto o químicamente unido a un líquido que es el que actúa como fase estacionaria (líquida, ej. en partición).

Dos técnicas cromatográficas en columna muy importantes son:

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) es una evolución de la cromatografía líquida en columna clásica. Utiliza columnas empaquetadas con partículas de fase estacionaria muy pequeñas y uniformes, y una fase móvil líquida que es impulsada a través de la columna a alta presión mediante bombas. Esto permite separaciones mucho más rápidas, eficientes (mayor resolución) y reproducibles.

Puede operar bajo diferentes mecanismos de separación (fase reversa -la más común-, fase normal, intercambio iónico, exclusión molecular, afinidad). Los distintos componentes separados que eluyen de la columna son detectados por diversos sistemas en línea (detector UV-Vis, de fluorescencia, de índice de refracción, electroquímico, de conductividad, espectrómetro de masas -LC-MS-, etc.) y representados en un gráfico (tiempo vs señal del detector) denominado cromatograma.

Cromatografía de Gases (GC)

Es una cromatografía realizada en columna cuya fase móvil es un gas inerte (gas portador, ej. Helio, Nitrógeno, Hidrógeno) procedente de una botella a presión. La muestra, que debe ser volátil o poder volatilizarse sin descomponerse, se inyecta en la corriente de gas portador. La columna (larga y estrecha, a menudo capilar) contiene la fase estacionaria, que puede ser un sólido (GSC, adsorción) o, más comúnmente, un líquido no volátil de alto punto de ebullición que recubre el interior de la columna capilar o impregna un soporte sólido empaquetado (GLC, partición).

La columna se encuentra dentro de un horno con temperatura controlada para asegurar la volatilidad de los componentes y optimizar la separación. La detección de las sustancias separadas que eluyen de la columna puede hacerse por diversas técnicas, como el detector de conductividad térmica (TCD), el detector de ionización de llama (FID, muy común para compuestos orgánicos), el detector de captura electrónica (ECD, para compuestos halogenados), o un espectrómetro de masas (GC-MS). Como en HPLC, los resultados se representan en un cromatograma.

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