Producción de Biomoléculas: Selección y Mejora de Microorganismos

Alcohol

1. Sembrar la levadura aislada en una placa de agar Papa Dextrosa Agar (PDA). Incubar a temperatura ambiente por 2 a 3 días.
2. Determinar la concentración celular de cada cultivo empleando una cámara de Neubauer. Colocar 3 ml de caldo Sb o SSF estéril en la placa, resuspender las células y extraer la suspensión a un tubo estéril.
3. Inocular suficiente suspensión celular para alcanzar una concentración de 10⁷ o 10⁸ cel/ml en 100 ml de mosto de uva con 20º – 25º grados Brix, en frascos de fermentación de 120 ml de capacidad.
4. Sellar los sistemas de fermentación e incubar durante 7 días a temperatura ambiente.
5. Determinar la cepa con mayor capacidad de producción de alcohol en forma indirecta por el consumo de azúcares reductores utilizando el refractómetro.
6. Repicar la cepa en 2 tubos de agar Sb, incubar a temperatura ambiente por 2 a 3 días y conservar a 4 ºC en refrigeración.

Mejoramiento

1. Luego de seleccionar la cepa por su mayor grado alcohólico.
2. Sembrar en la superficie de placas Petri conteniendo agar papa dextrosa (PDA) la superficie de levaduras seleccionada utilizando un hisopo estéril embebido con solución salina fisiológica.
3. Exponer a radiación ultravioleta por 5, 10 y 15 minutos y a una distancia de aproximadamente 30 cm. Una de ellas sin exposición (tapada) la cual sería nuestra placa control.
4. Colocar un pedazo de algodón embebido con alcohol de 75º en un lado de la placa.
5. Incubar a temperatura ambiente por 24 a 72 horas.
6. De las colonias que han crecido, repicar en tubos con PDA.
7. Incubar a temperatura ambiente por 24 a 72 horas.
8. Realizar la evaluación de producción de alcohol de las levaduras seleccionadas.
9. Repicar la levadura de mayor producción de alcohol, incubar y conservar en refrigeración.

Entomopatógenos

Tratamiento térmico y enriquecimiento

Las larvas muertas de lepidópteros se lavarán dos veces en agua destilada estéril, en frasco de penicilina con 5 mL. Luego se traslada a tubos de ensayo conteniendo 2 mL de agua peptonada al 1%. En este medio se triturarán las larvas con una bagueta y se llevarán a tratamiento térmico de 80ºC por 10 minutos, seguido de un choque térmico en refrigeración de 5 a 10 minutos. Se incubarán los tubos a temperatura ambiente para su enriquecimiento.

Siembra de las muestras y aislamiento

A partir de los tubos enriquecidos se siembra por estría y agotamiento en dos placas de agar nutritivo (AN) y se incubarán las placas a 37ºC por 24 horas.

Identificación

Realizar un estudio macroscópico y microscópico de las colonias presentes en las placas con AN. Repicar las colonias obtenidas en tubos con agar nutritivo inclinado por el método de estría. Incubar a 37ºC por 24 horas. Refrigerar los cultivos.

Selección para bacterias entomopatógenas

1. Sembrar en tubos con caldo nutritivo de las colonias seleccionadas e incubar a 37ºC por 48 – 72 horas.
2. Realizar extensiones en láminas con cada uno de los cultivos y realizar coloraciones con el azul de Coomassie por espacio de 5 min. Luego lavar las láminas y observar al microscopio los cristales proteicos.
3. Repicar en AN los cultivos que presentaron cristales proteicos, incubar a 37ºC por 24 horas y refrigerar.

Amilasa

1. Sembrar por puntura cada cepa desarrollada en placas de agar almidón al 1%. Incubar a 37°C durante 18 a 24 horas.
2. Adicionar lugol en la superficie del medio y anotar el diámetro del halo de transparencia generado por la degradación del almidón por efecto de las amilasas.
3. Replicar por estría en tubos con agar nutritivo aquella cepa que genere el halo de mayor diámetro. Incubar a 37°C por 18 a 24 horas y conservar a 4°C en refrigeración.

Interacciones entre Microorganismos

• Competición: una comunidad de dos o más especies están limitándose mutuamente. Ellos dependen de factores externos comunes.
• Comensalismo: el crecimiento de una especie es promovida por la presencia de una segunda especie en una población.
• Mutualismo: ambos microorganismos crecen más rápido cuando están juntos que cuando están separados. Puede deberse a factores de crecimiento o productos que sirven como productos.
• Sinergismo: es un tipo de comensalismo en los cuales la formación de productos específicos es mayor en cultivos mixtos que en puros.
• Amensalismo: el crecimiento de una especie es reprimida por la presencia de sustancias mixtas producidas por otros.
• Neutralismo: ambas especies no tienen un efecto observable sobre el otro.
• Simbiosis: asociación mutualista, es necesario que uno de ellos sobreviva para la sobrevivencia del otro.
• Parasitismo: ocurre cuando un microorganismo se alimenta y reproduce a expensas de los fluidos del tejido y del cuerpo del otro.

Libre competencia

Dos especies compiten por el mismo sustrato limitante. Está determinada por la concentración del sustrato limitante sobre la tasa específica de crecimiento de cada especie.

En un cultivo Batch, donde la concentración inicial del sustrato limitante es mucho mayor que el valor de Ks, cada especie crecerá a su máxima tasa hasta que el sustrato se agote.

En un cultivo continuo, el organismo con tasa de crecimiento más rápida desplaza al otro del medio.

Metabolismo

Metabolismo Primario

Proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos (gelanos y xantanos), poliésteres, ácidos grasos (insaturados y esteroles), azúcares (fructosa, ribosa, sebosas), ácidos orgánicos, alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoácidos (Lys, Thp, Phe), vitaminas (B12, B2), nucleótidos, saborizantes (ácido inosínico y guanílico), polisacáridos y poliésteres de reserva.

Metabolismo Secundario

Antibióticos, toxinas, inhibidores de enzimas, pesticidas y hormonas.

Manipulaciones Más Frecuentes

Alteración de la regulación por retroalimentación

Controles: evitan la superproducción de aminoácidos y nucleótidos. Para eliminar este control se han empleado dos tipos de manipulaciones:

• Alteración de la acumulación de productos finales
• Obtención de mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación

Alteración de la permeabilidad

Superproducción de ácido glutámico (aa más importante producido por fermentación), Glutamato monosódico: potenciador de aromas.

• Deficientes en la enzima α-cetoglutarato deshidrogenasa.
• Requerimiento nutricional de biotina.
• La deficiencia de la enzima: canaliza metabolismo hacia glutamato.
• La deficiencia en el bloque biosintético de la biotina: alteración de la permeabilidad de la membrana y excreción del glutamato.

Para alterar la permeabilidad se añade:

*Penicilina durante fase log. Penicilina no inhibe síntesis de fosfolípidos, produce inmediata excreción de fosfolípidos.*Detergentes.

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