Estudio de la Funcionalidad de los Linfocitos B

Los linfocitos B (LB) pueden ser inducidos a dividirse in vitro, lo que se utiliza para evaluar su funcionalidad. Estas determinaciones in vitro reflejan las respuestas inmunológicas que se producen in vivo en el organismo del paciente. La determinación de la producción de anticuerpos (Ac) es un parámetro de evaluación de la funcionalidad de LB y contribuye al diagnóstico de diversas inmunodeficiencias.

Cuantificación de Inmunoglobulinas

Se cuantifican los niveles de IgG, IgM e IgA. El método más habitual es la inmunodifusión radial, aunque también se emplea la turbidimetría.

Cuantificación de Anticuerpos Específicos

Para la cuantificación de Ac específicos la técnica de elección es el método ELISA indirecto. Se puede determinar la presencia de Ig en los sobrenadantes procedentes de cultivos in vitro de linfocitos estimulados con antígenos (Ag) o mitógenos. Se utiliza ELISA.

Cuantificación de los Linfocitos

1. Citometría de flujo (técnica de elección): Cuantificación de subpoblaciones linfocitarias mediante citometría de flujo. Se usan anticuerpos monoclonales frente a marcadores: CD3+: LT, CD4+: LTh, CD8+: LTc, CD16+/CD56+: células NK y CD19: LB.
2. Técnica de formación de rosetas E: Los linfocitos T (LT) humanos poseen en su superficie una molécula (CD2) que permite su unión espontánea a eritrocitos de carnero in vitro, formando agrupaciones denominadas rosetas E. Solo los forman LT viables.
3. Prueba de citotoxicidad por liberación de cromo: Se emplea para la determinación de LTCD8. La técnica se basa en la capacidad de los LTCD8 de lisar células diana que expresen el Ag. Las células diana se marcan con un isótopo radiactivo, el ⁵¹Cr. Cuando el Ag es reconocido por el del LTCD8, se induce la lisis de la célula diana. Esto provoca la liberación del ⁵¹Cr al medio y la radioactividad se lee en un contador gamma. El uso de un isótopo radiactivo es un inconveniente de esta técnica.

Estudio de la Funcionalidad de los Linfocitos T

1. Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos: Cuando los LT sensibilizados frente a un Ag se cultivan en presencia de ese Ag o de un agente mitógeno, responden transformándose en linfoblastos, que se dividen activamente. Se produce una síntesis de ADN que se puede medir mediante la tasa de incorporación de timidina tritiada a las células.
2. Estudio de la proliferación mediante citometría de flujo: Se utiliza la capacidad del CFSE para marcar los linfocitos.
3. Valoración de citoquinas: Se estudian las citoquinas en los sobrenadantes de los cultivos estimulados con Ag o mitógenos. Se realiza un ELISA sándwich. A partir de una curva patrón obtenida con citoquinas recombinantes se obtienen los valores de las muestras problema que se expresan en U/ml. También se pueden cuantificar células individuales que están secretando una citoquina concreta in vitro mediante ELISPOT o ensayo de inmunospot conjugado a actividad enzimática. También se puede utilizar la citometría de flujo. Las células son estimuladas con Ag o mitógeno durante 48 horas y posteriormente son transferidas a pocillos de placas que han sido tapizadas con un Ac anti-citoquina durante 18-22 horas. El siguiente paso es añadir un Ac anti-citoquina marcado con una enzima. Para finalizar, se añade el sustrato de la reacción que permitirá visualizar los sitios de secreción de citocinas como un punto. Estos pueden contarse con un lector ELISPOT automatizado o manualmente utilizando un microscopio.
4. Pruebas de hipersensibilidad cutánea retardada: Inoculación intradérmica de una cantidad conocida de Ag denominado PPD (derivado proteico purificado). Tras 48-72 horas se realiza la observación del sitio de inyección y se observa la aparición de una pápula de diámetro superior a 2 mm la reacción se considera positiva. Una prueba negativa hace sospechar algún tipo de inmunodeficiencia.
5. Determinación de proteínas mediante la técnica Western blot:
   • ZAP-70: se expresa en LT y en células NK, intervienen en la selección en el timo de los linfocitos.
   • JAK3: proteína Kinasa que interviene en la transducción de señales al núcleo celular tras la interacción de las citoquinas con el receptor de membrana del linfocito. Ambas se encuentran alteradas en las inmunodeficiencia combinada severa.

Estudio de las Células Fagocíticas

1. Evaluación de la capacidad fagocítica: Se incuba una fracción de leucocitos de sangre periférica con una suspensión de partículas inertes o de microorganismos para permitir la fagocitosis y posteriormente se cuantifica mediante observación de las células teñidas.
   • Inconveniente: no distingue entre las partículas fagocitadas y partículas adheridas a las superficies celulares. También se puede cuantificar por citometría de flujo marcando las bacterias con colorantes fluorescentes.
2. Evaluación de la activación de los fagocitos: Prueba de reducción del NBT (Nitroblue tetrazolium o azul de tetrazoilo nitrado): El NBT es un compuesto soluble amarillo que tras ser endocitado por fagocitos que hayan generado ión superóxido forma cristales de color púrpura oscuro. De esta manera se pueden detectar los fagocitos que se han activado.
3. Evaluación de la actividad microbicida: Se incuba con una cantidad conocida de microorganismos y posteriormente se realiza un recuento de la viabilidad residual del agente microbiano. La disminución del número de unidades formadoras de colonias nos indica la eliminación del agente por parte de los fagocitos.
4. Ensayos de quimiotaxis: Sirven para cuantificar la locomoción direccional de los neutrófilos atraídos por diferentes estímulos. Se usan dispositivos de dos cámaras aisladas y separadas por un filtro. En una de las cámaras se sitúan las células y en otra un agente quimiotáctico.
   • En la cámara Boyden los neutrófilos atraídos por las sustancias del compartimento inferior intentan desplazarse, pero quedan atrapados en la membrana. Tras un periodo de incubación, la membrana se tiñe y es visible al microscopio.

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