29 Ago
Hibridación
La **hibridación** de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos, por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria. Las técnicas de hibridación permiten detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos o dianas (ADN o ARN) mediante el empleo de sondas marcadas.
- Secuencia diana: secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la muestra problema.
- Sondas: cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana.
- Hibridación: es un proceso de construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios.
Se utiliza en biología molecular para detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos mediante el empleo de fragmentos complementarios o sondas que se marcan para ser visualizados.
Técnicas de Hibridación
- Fases de la hibridación:
- Preparación de la muestra y soporte (prehibridación).
- Hibridación.
- Lavado de poshibridación.
- Detección del híbrido.
- Clasificación: Las técnicas de hibridación se pueden clasificar según el medio o soporte en el que se lleve a cabo en: técnicas de hibridación en soporte sólido, en medio líquido e in situ.
Las Sondas
- Características:
- Especificidad: capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que se tiene que hibridar. Tamaño mínimo 16 bases.
- Sensibilidad: probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana.
- Tipos:
- Sondas de ADN (de síntesis química, de ADN recombinante y PCR).
- Sondas de ARN (de síntesis química y transcripción).
- Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos (Sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA): se sustituye el esqueleto azúcar-fosfato por un esqueleto formado por unidades de aminoetil-glicina que se unen por enlace amida. Sondas de ácidos nucleicos bloqueados (LNA): se modifican algunas ribosas).
- Purificación de la sonda marcada: consiste en la eliminación de los nucleótidos libres marcados para evitar ruido de fondo o interferencias en los resultados de las técnicas de hibridación. Los dos métodos más usados para la purificación de las sondas son cromatografía de exclusión por tamaño y de adsorción.
Dot Blot
Técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido. Permite detectar secuencias de ADN o ARN en una mezcla compleja. Sobre las membranas se coloca una gota de la muestra que se va a analizar, que puede ser: un ácido nucleico purificado, un lisado celular, etc. Permite el estudio simultáneo de varias muestras, aplicando cada muestra en una zona distinta de la membrana. Se puede realizar con: sondas radiactivas y marcadas con haptenos. Si las aplicaciones se realizan en forma de banda en lugar de en forma circular, la técnica se denomina **Slot blot**.
La técnica se lleva a cabo incubando secuencialmente las membranas con los reactivos por inmersión en cubetas, en bolsas de plástico termosellables o con cierre hermético o en frascos con tapón de rosca.
Protocolo
- Aplicación de la muestra al soporte:
- Humedecer la membrana que actúa de soporte sólido mediante inmersión durante 10’ en un tampón adecuado o en agua destilada, según el tipo de membrana.
- Transcurrido el tiempo, se saca del líquido humectante y se retira el exceso de este.
- Una vez humedecida la membrana, se ensambla en un sistema de vacío, que permite que se consiga la fijación de la muestra a la membrana.
- El proceso de aplicación de la muestra varía para ADN y ARN.
- Prehibridación:
- Las membranas con las muestras se incuban con una solución de prehibridación para bloquear las posibles uniones inespecíficas de la sonda a la membrana.
- Las soluciones de prehibridación suelen tener la misma composición que las soluciones de hibridación, pero sin sonda.
- La membrana se incuba con esta solución a la misma temperatura a la que se realizará después la hibridación, normalmente a 65-68ºC.
- Hibridación:
- Las sondas de ADN bicatenario se desnaturalizan justo antes de su uso, mediante calentamiento y enfriamiento rápido en hielo.
- Una vez que se ha retirado la solución de prehibridación, esta se sustituye por un volumen igual de solución fresca al que se le añade la sonda recién desnaturalizada.
- La membrana se incuba con esta solución a la temperatura adecuada, en agitación y durante el tiempo necesario (4-24 horas).
- Lavado poshibridación:
- Si las dos fases anteriores se han llevado a cabo en bolsa, se saca la membrana de la bolsa y se coloca en una cubeta para realizar los lavados de poshibridación en agitación.
- Se realizan dos o tres lavados.
- Detección del híbrido:
- Se realiza según el tipo de marcaje que lleve la sonda:
- Marcado radiactivo: se seca la membrana y se revela colocando una placa radiográfica encima y se mantiene en oscuridad. Al revelar la placa aparecerán puntos negros en las posiciones correspondientes a las muestras positivas, es decir, aquellas que contenían la secuencia diana.
- Marcado con haptenos: se revela con un método de detección cromogénica. El resultado final es una mancha coloreada en las posiciones correspondientes a las muestras positivas.
- Se realiza según el tipo de marcaje que lleve la sonda:
Aplicaciones
- Técnica de rastreo o screening para detectar secuencias de interés en múltiples muestras simultáneamente.
- ASO dot blot: para detectar mutaciones mediante el empleo de oligonucleótidos específicos de alelo, ASO.
- Dot blot inverso: tiene el mismo fundamento que el ASO dot blot, pero lo que se inmoviliza en la membrana son los distintos oligonucleótidos específicos de alelo (normales y mutados) sin marcar. Permite estudiar genes con un gran número de variantes alélicas.
- Hibridación de colonias: se utiliza para detectar bacterias que portan una secuencia genética concreta.
- Hibridación de placas o plaque lift: se detectan virus que portan la secuencia diana.
Southern Blot
Técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nylon. Permite la detección simultánea de varias secuencias diana de distintos tamaños con una única hibridación.
Protocolo
- Digestión enzimática: Se realiza con una o varias enzimas de restricción. Su objetivo es trocear el ADN de partida en fragmentos de diferentes tamaños. El protocolo de digestión varía mucho dependiendo de la enzima empleada y del ADN de partida.
- Electroforesis en gel: El ADN digerido se somete a una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida para separar los fragmentos producidos según tamaño. En el gel se puede incorporar un agente intercalante fluorescente, lo que permite fotografiarlo después de terminar la electroforesis. Esta fotografía permite comparar el patrón de bandas de ADN obtenido con el resultado de la hibridación.
- Transferencia del ADN a la membrana: En este paso se obtiene una réplica exacta del patrón de bandas de ADN en el gel sobre una membrana de nitrocelulosa o nailon. Incluye los siguientes pasos: desnaturalización del ADN, transferencia a la membrana y anclaje del ADN a la membrana.
- Hibridación: Se realiza incubando la membrana con los distintos reactivos dentro de una bolsa con cierre hermético. Se realiza a la temperatura adecuada y en agitación. La hibridación se realiza con la sonda o sondas específicas marcadas y diluidas en una solución adecuada.
- Revelado: Se realiza mediante autorradiografía con una película de rayos X, de manera que aparecerá una mancha oscura en los puntos de la membrana en que se localicen los híbridos sonda/secuencia diana.
Aplicaciones
- Elaboración de huellas genéticas y estudio de mutaciones estructurales.
Northern Blot
Técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ARN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nailon.
Se parte de ARN purificado y se procede de forma muy parecida a la técnica de Southern Blot con dos diferencias: no se requiere digestión enzimática y no es necesario el paso de desnaturalización antes de la transferencia del gel a la membrana.
Aplicaciones
- Análisis de expresión génica y detección de mutaciones.
Microarrays
Los **microarrays** de ADN son conjuntos de fragmentos de ADN (sondas) distintos fijados a una superficie sólida (vidrio, plástico o silicio). Los microarrays también son conocidos como **biochips**. Las sondas fijadas en el biochip son monocatenarias y no están marcadas. Se marca con fluorocromos la muestra que se va a estudiar. La lectura del resultado obtenido tras la hibridación requiere un escáner de lectura.
En la fabricación de los microarrays se pueden seguir dos métodos: depositar las sondas una a una, en posiciones determinadas del soporte sólido y sintetizar las sondas sobre la propia superficie (sondas pequeñas).
Protocolo
- Marcaje de la muestra.
- Hibridación.
- Lectura e interpretación del microarray.
Aplicaciones
- Hibridación genómica comparada en arrays (aCGH): permite detectar e identificar alteraciones genéticas consistentes en pérdida o ganancia de material genético, mediante la comparación del ADN de una muestra con un ADN de referencia.
- Estudios de expresión génica.
Técnica de Captura de Híbrido
Se basa en la formación de híbridos ARN/ADN que serán reconocidos o capturados por anticuerpos específicos. Si la secuencia diana es ADN, la sonda será de ARN y si la secuencia diana es de ARN, la sonda será de ADN. La captura del híbrido ARN/ADN se produce mediante anticuerpos específicos que se hallan fijados en las paredes de pocillos de una placa microtiter. Esta técnica se desarrolló inicialmente para detectar el virus del papiloma humano (VPH) en muestras cervicales (cuello uterino).
Comparativa CISH y FISH
- No requiere microscopio de fluorescencia / Requiere.
- Mayor estabilidad de sonda / Hasta el momento, poca experiencia del patólogo.
- El patólogo está más habituado / Permite trabajar con 2-4 sondas de distinto color.
- Mayor tiempo de procesado / Menor.
- Visualiza 1-2 colores / Mayor sensibilidad.
Técnica del ADN Ramificado
Consiste en un sistema de amplificación de señal, basado en la unión de la secuencia diana a un macrocomplejo de ADN, de tipo arborescente, mediante sucesivas hibridaciones. Se diseñó para aumentar la sensibilidad de las técnicas de captura de híbrido, haciendo posible su cuantificación. Esta técnica es usada para la cuantificación de cargas virales en muestras biológicas.
Protocolo
- Lisis de las partículas víricas y desnaturalización.
- Hibridación con sondas específicas:
- Sondas para captura: parte complementaria al ADN vírico y otra a un oligonucleótido de captura fijado en un pocillo.
- Sondas de extensión: una parte es complementaria a la región del ADN vírico y la otra a un oligonucleótido preamplificador.
- Captura del híbrido.
- Preamplificación. Oligonucleótido preamplificado.
- Amplificación. Oligonucleótidos amplificadores.
- Detección. Oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalina.
- Revelado. Sustrato quimioluminiscente.
Hibridación in Situ Fluorescente (FISH)
Se basa en el empleo de sondas marcadas con fluorocromos, que son detectadas visualizando las preparaciones con un microscopio de fluorescencia. Se puede realizar en: cromosomas en metafase, núcleos interfásicos desnudos y secciones de tejido congelado. Su principal aplicación es la detección de alteraciones cromosómicas, tanto numéricas como estructurales en relación con el diagnóstico de patologías oncológicas o con base genética.
Protocolo
- Hibridación: se realiza directamente sobre la preparación, aplicando la sonda marcada.
- Lavado de poshibridación: se realizan por inmersión de los portaobjetos en soluciones de lavado colocadas en cubetas Coplin.
- Contratinción: se añade la solución de contratinción sobre el área de hibridación. La solución de contratinción contiene diamino-fenil-indol (DAPI) que con luz ultravioleta emite una fluorescencia azul.
- Visualización: con un microscopio de fluorescencia. En el caso de preparaciones en metafase, los cromosomas se visualizan en color azul, mientras que las regiones en que se localizan las secuencias diana aparecen como puntos o manchas tojas o verdes. Si la preparación es de núcleos desnudos, estos se visualizan en color azul con puntos verdes o rojos en su interior, correspondientes a los híbridos formados entre la sonda y la secuencia diana.
Hibridación in Situ Cromogénica (CISH)
La hibridación in situ cromogénica se caracteriza porque el híbrido se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un producto coloreado visible con un microscopio óptico convencional de luz transmitida.
Se realiza principalmente sobre secciones de tejido.
Protocolo
- Desparafinado y rehidratación: la inclusión en parafina es un método habitual de conservación de tejidos durante periodos prolongados.
- Digestión enzimática: libera los ácidos nucleicos de su unión a histonas y otras proteínas.
- Prehibridación: para bloquear posibles uniones inespecíficas de la sonda al tejido.
- Hibridación: se realiza directamente sobre la preparación, aplicando la sonda marcada.
- Lavado de poshibridación: se realizan por inmersión de los portaobjetos en soluciones de lavado colocadas en cubetas Coplin.
- Detección del híbrido: se elige un método u otro en virtud del marcador empleado y del tamaño de la sonda.
- Contratinción: tras el revelado en el tejido aparecen manchas coloreadas en las regiones en que se encuentra la secuencia diana. Sin embargo, el resto del tejido no es visible al microscopio, por eso es necesario contrateñir el tejido con una tinción suave, que no enmascare el resultado de la ISH.
- Visualización: con un microscopio óptico.
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