La Fuerza Centrífuga Relativa

R = radio de rotación en cm; v = velocidad de rotación en rotaciones por minuto (r.p.m), la RFC es la fuerza relativa de centrifugación en número de gravedad. K = constante = 1,118.10^-5

Ultracentrífuga: Utilidad y Posibles Dificultades

Se utiliza en los laboratorios especializados para la separación de los distintos tipos de lipoproteínas presentes en el plasma. Las dificultades en las ultracentrífugas son que pueden plantearse algunos problemas como rozamiento o calentamiento.

Fundamentos de las Técnicas de Separación

Centrifugación

Consiste en separar dos fases de distinta densidad o las partículas sólidas del líquido en el que están suspendidas, mediante la aplicación de una fuerza centrífuga.

Electroforesis

Separa las moléculas en relación a su carga eléctrica neta (suma de cargas positivas y negativas).

Cromatografía

Técnica que separa los componentes de una muestra mediante su diferente distribución entre una fase fija y otra móvil.

Separación de Proteínas Séricas mediante Electroforesis

Cátodo: electrodo negativo; ánodo: electrodo positivo; anión: moléculas cargadas negativamente; catión: moléculas cargadas positivamente. En un sistema electroforético actúan dos fuerzas opuestas sobre cada molécula cargada: la fuerza debida al campo eléctrico y la fuerza debida a la resistencia del medio.

Factores que Influyen en la Electroforesis

El flujo electroosmótico: influye en la movilidad electroforética, dependiendo esta de la naturaleza del soporte, la temperatura: el ascenso de la temperatura origina una evaporación que produce un incremento de la concentración del electrolito presente en la solución tampón, difusión y adsorción.

Elementos Necesarios para la Realización de una Electroforesis

• Soporte: es el medio en el que se separan las moléculas.
• Solución tampón: ajusta el pH.
• Aplicador: objeto con el que se deposita la muestra en la tira.
• Cubeta: recipiente donde se produce la electroforesis.
• Alimentador: proporciona corriente eléctrica.
• Colorantes: para percibir mejor las bandas tras la electroforesis.

Electroforesis: Significado y Utilidad

Soportes de Clase I

Permiten la separación molecular por la carga eléctrica neta de las moléculas que queremos separar.

Tampón

Es una solución que se utiliza para mantener un pH constante, garantizando así que las moléculas conserven la carga eléctrica constante.

Rojo Ponceau

Potencia el color de las bandas de la electroforesis de hemoglobinas y proteínas séricas.

Cuantificación de Resultados de Electroforesis: Método Espectrofotométrico

Una vez realizada la electroforesis, cortamos las bandas obtenidas en las tiras, depositamos las bandas cortadas en un tubo de ensayo (cada banda en un tubo) que contenga el disolvente apropiado, y medimos la absorbancia de la disolución obtenida.

Isoelectroenfoque

Técnica similar a la electroforesis, pero se diferencia de esta en que la solución tampón utilizada está constituida por anfolitos.

Cromatografía

Conjunto de métodos analíticos utilizados para la separación de los componentes de una muestra, mediante su diferente distribución entre una fase fija y una móvil.

Cromatografía: Mecanismo de Actuación de la Fase Fija

• Adsorción: interacciones de tipo electrostático. Fase fija = sólida.
• Partición: diferente solubilidad entre fase móvil (FM) y fase fija (FF) inmiscibles. FF = líquida.
• Intercambio iónico: separación de tipo electrostático. FM = líquida y FF = sólida.
• Exclusión molecular: basada en el diferente tamaño molecular de los analitos a separar. FM = líquida y FF = sólida.
• Afinidad: basada en la afinidad que presentan los ligandos contenidos en la FF que interaccionan con analitos específicos de la FM. FM = líquida y FF = sólida.

Cromatografía de Capa Fina

Poner 1 cm de disolvente en un tarro de cristal, cortar una lámina con un tamaño de 5×10 cm, marcar las puntas de aplicación a 1,5 cm de la base, aplicar las gotas de muestra en las marcas con un capilar, meter la tira en el tarro durante 1 hora aproximadamente, cuando el disolvente haya subido 8 cm aproximadamente sacar la tira y dejarla secar al aire, pulverizar con ninhidrina la tira, dejar secar en la estufa 1-2 minutos y observar resultados.

Significado de R_f

Factor de retención: es el cociente entre la distancia recorrida por el analito (detectado en forma de mancha) y la recorrida por el eluyente.

Partes de un Cromatógrafo Líquido

• Inyector: permite la introducción de la muestra en la “cabeza” de la columna.
• Eluyente: es la fase móvil, que suele ser una mezcla de dos sustancias.
• Bomba: establece un flujo de eluyente a la presión necesaria desde el frasco en que está hasta la columna.
• Columna: cilindro de acero inoxidable cuya superficie interna está formada de vidrio.
• Detector: analiza continuamente el eluyente que sale de la columna, para detectar la presencia de analitos, previamente separados.

HPLC

Se utiliza para la identificación de un analito, calcular el área de cada pico, el porcentaje de dicha área y la concentración del analito en la muestra.

nalito en la muestra.

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