08 Dic
TIPOS DE MUESTRAS SEGÚN SU PROCEDENCIA –
Muestras procedentes de líquidos fisiológicos como por ejemplo sangre, orina líquido cefalorraquídeo, liquido pleural, liquido prostático, contenido gástrico -Muestras procedentes de líquidos y fluidos patológicos, liquido de derrames, pleural, peritoneal, contenido de un quiste, expectoración bronquial, liquido procedente del lavado de esófago, estómago, colon. – Y las procedentes de cito punciones como por ejemplo la punción de médula ósea, la punción hepática. – Muestra procedentes de frotis legrados como por ejemplo el frotis vaginal y el cepillado bronquial. – Piezas operatorias.
TOMA DE MUESTRAS
El estudio citológico se puede realizar sobre diversos tipos de muestras: lesiones cutáneas o subcutáneas, ganglios linfáticos, órganos, piel, médula ósea, líquidos orgánicos, etc. Existen cuatro tipos de técnicas para obtener muestras: a. Impronta. b. Raspado.c. Frotis. d. Punción-Aspiración con aguja fina (PAAF).
Impronta
Esta técnica consiste en apoyar un portaobjetos sobre el tejido lesionado para que las células desprendidas de la lesión se adhieran al porta. Se puede realizar con fragmentos de tejido obtenidos por biopsia o bien en lesiones externas en anima-les vivos. Cuando utilizamos fragmentos de tejido es conveniente que apoyemos varias veces, sin presionar, la cara de la muestra sobre un papel secante, para eliminar la contaminación de sangre en la muestra.Posteriormente, apoyaremos la muestra varias veces sobre portas limpios hasta que obtengamos una capa uniforme y fina de células. Si utilizamos esta técnica en lesiones externas del animal vivo, es importante realizar una impronta, apoyando ligeramente el porta sobre la zona afectada, antes de lavar la lesión. Después, lavaremos la lesión con una gasa y suero fisiológico, reavivaremos la lesión mediante raspado con una cuchilla de bisturí, secaremos con material absorbente, y volveremos a realizar otra impronta.
Raspado
Esta técnica consiste en el raspado con una cuchilla de bisturí de la superficie de una lesión. Su mayor utilidad es el estudio de lesiones externas. Primero lavaremos la lesión con suero fisiológico y secaremos la zona con papel absorbente. Echaremos una gota de aceite sobre la zona elegida y sobre la hoja de bisturí para que se adhiera el material que vamos a raspar. Posteriormente apoyaremos el filo de la cuchilla perpendicular a la superficie de la lesión y la desplazaremos varias veces sobre la misma, sin ejercer excesiva presión. El material obtenido se transfiere al centro de un portaobjetos limpio y se extiende siguiendo cualquiera de las técnicas que comentaremos posteriormente en la preparación de extensiones.
Frotis
Esta técnica consiste en la obtención de células deslizando suavemente un hisopo o bastoncillo de algodón sobre una superficie orgánica. Conviene humedecer el bastoncillo con suero fisiológico para prevenir el daño en las células de la muestra. Se usa, fundamentalmente, cuando no es posible obtener muestras mediante impronta, raspado o aspiración con aguja fina, por ejemplo en trayectos fistulosos, citología vaginal, etc. Para realizar un raspado echaremos una gota de aceite sobre la zona y sobre la hoja de bisturí para mejorar la adherencia de la muestra. Una vez obtenida la muestra, deberemos apoyar y hacer rotar el hisopo sobre el porta, sin ejercer mucha presión y sin pasar dos veces por el mismo sitio. Para realizar un raspado echaremos una gota de aceite sobre la zona y sobre la hoja de bisturí para mejorar la adherencia de la muestra.
Otra forma es mediante centrifugación:
es una técnica útil para muestras seromucosas y grandes volúmenes de líquidos serosos (liquido quístico y procedentes de lavados). El método consiste en: – Anotar el aspecto mucoso de la muestra. – Agitar la muestra para después resuspender las células que contiene y verter igual cantidad en dos tubos de centrifuga. – Se centrifuga a una velocidad aproximada de 2000rpm, durante 5 minutos, una vez centrifugado se decanta el sobrenadante, mezclar el sedimento con unas gotas de sobrenadante para resuspender las células y depositar con una pipeta pasteaur una gota de este sedimento sobre un porta previamente identificado. – Realizar una extensión directa con esta parte de la muestra o citocentrifugarla. – Fijar rápidamente con la solución fijadora.
Citocentrifugación:
esta técnica se hace con una centrifuga llamada citospyn. Pequeñas alícuotas (cantidades iguales) de muestra líquida se hacen girar lateralmente sobre un porta para formar una monocapa de células. Es una técnica de gran utilidad y rapidez para la preparación de muestras líquidas.
FIJACIÓN
Su principal objetivo es conservar el detalle morfológico de la células en el estado lo más parecido posible a la célula en el tejido vivo. Esto se consigue con fijadores que deshidratan las células, inactivan los enzimas autolíticos, coagulan las proteínas y penetran en la membrana celular. Es un paso indispensable si no queremos una extensión deteriorada u oxidada que no tome bien los colorantes y que no permita una correcta lectura cuando se estudia al microscopio. La fijación debe realizarse de inmediato a la toma y la extensión del material citológico cuando la preparación esté todavía húmeda. No existe el fijador perfecto, todos causan contracción celular y cada uno actúa con una velocidad diferente.
Procesos previos a la fijación
Extensión
En el caso de las muestras obtenidas por raspado o por PAAF, el material obtenido debe ser extendido sobre el porta para formar una capa fina de células que permita una correcta visualización. Es muy importante realizar el manejo de la muestra con mucho cuidado, evitando ejercer excesiva presión para no dañar las células. Para evitar que la muestra se seque, deberemos realizar la extensión lo más rápidamente posible una vez que coloquemos la gota de muestra en el portaobjetos. Todas las extensiones deben de ser marcadas con rotuladores indelebles al alcohol o con lapicero (en portas esmerilados) para su correcta identificación. Existen varias formas de realizar la extensión, aquí os desarrollamos dos de ellas la técnica de “aplastamiento” (squash) y la de extensión. ·
Técnica de “aplastamiento” (squash):
Esta técnica de extensión consiste en los siguientes pasos: – Poner el material en forma de gota en uno de los extremos del porta. – Apoyar sin ejercer mucha presión un segundo porta por una de sus caras y en sentido perpendicular al primero. – Con un movimiento rápido, deslizar el segundo porta sobre el primero.
Técnica de extensión sanguínea:
Está técnica de extensión puede usarse cuando la muestra obtenida es muy fluida. Se utiliza sobre todo para extender las gotas de sangre para hacer un frotis. Utilizaremos dos portas, uno con la gota de muestra en un ex-tremo, y el otro para realizar la extensión. El porta derriba puede ser sustituido por un cubre. – Apoyaremos uno de los bordes cortos del porta de extensión (o un cubre), sobre el porta con la muestra, formando un ángulo de 30-40º. – Deslizaremos el porta de extensión hasta contactar con la gota, con lo que el material se extenderá en forma de línea en el borde corto del porta de extensión. – Con un movimiento rápido y suave deslizamos el porta de extensión, alejándonos de la gota, formándose una capa uniforme.
FILTROS DE MEMBRANA
:Constituyen una técnica de concentración de células en muestras líquidas de baja densidad celular (orina) ya que rescatan mayor número de células que la citocentrifugación. Estos filtros son membranas porosas de plástico cuyos poros van de 10 – 8 micras. Los más utilizados son: – Tipo millipore (de acetato de celulosa). – Filtros nucleopore (de policarbonato). Se realiza una filtración con la muestra y posteriormente se examina el filtro. En citología se usan sobre todo los filtros SM, cuyos poros van de 1 – 2 a 5 micras, cada cm2 de superficie contiene millones de poros capilares que ocupan más del 80 % del volumen total. Este filtrado no necesita ningún fraccionamiento del líquido y no hay que extraer el sedimento y colocarlo sobre el pota objetos; ello permite una estimación cuantitativa de las células cancerosas en un volumen de líquido dado pero en cambio pueden haber superposiciones celulares molestas y la membrana filtrante experimentar una desecación rápida. El líquido se filtra a la presión atmosférica o a una presión negativa de 25 mm de mercurio, una presión negativa más fuerte no es aconsejable ya que podría deformar las células. La fijación debe hacerse únicamente con alcohol etílico de 95º pues el alcohol absoluto, el éter o la acetona provocarían la disolución del filtro. El filtro con la muestra sujeto con una pinza se coloca sobre un portaobjetos y se tiñe.
FIJACIÓN Y TINCIÓN
Para que las células se adhieran al portaobjetos, y para evitar que se degeneren las células, hay que fijar la muestra. El método de fijación puede variar según la técnica de tinción que se vaya utilizar. Normalmente en la clínica o para el envío de muestras a otro laboratorio la muestra debe de secarse al aire y luego debe fijarse con metanol. También puede utilizarse el primer reactivo de las técnicas rápidas. Muchas veces la tinción de las extensiones citológicas se hace en la propia clínica para realizar allí su interpretación pero otras veces se remite. Si la muestra se remite a un laboratorio especializado es mejor no teñirlas en la clínica, hay que fijarlas y dejarlas sin teñir. Cuando la preparación se tiñe en la clínica se usa normalmente la Técnica rápida Diff-Quik. Esta técnica de tinción es muy utilizada debido a su sencillez y rapidez, todos sus reactivos son comerciales y están ajustados para realizar la técnica en el menor tiempo posible.
Citospray:
es un fijador en forma de aerosol. Es un producto comercial que contiene una mezcla de alcohol isopropílico y una materia plástica, el polietilglicol, protectora de la desecación. Con este spray se pulveriza toda la superficie del porta de forma rápida y sencilla, se debe aplicar a 25 – 30 cm. de distancia de la muestra. Se aplica al material citológico inmediatamente después de su extensión en el porta. Es muy usado por su simplicidad y buenos resultados, se recomienda sobre todo cuando las extensiones deben ser enviadas a otros laboratorios para su tinción (extensiones ginecológicas, cepillados orofaringeos, esofágicos, bronquiales…). Por el contrario debe evitarse su uso en extendidos de materiales líquidos realizados en el propio laboratorio y en los hemáticos para no provocar agrupamientos de los hematíes. Antes de teñir debe extraerse el citospray mediante pases sucesivos de 5 – 10 minutos cada uno por etanol al 96 %. Alternativamente y dado que el líquido del aerosol es soluble en agua, al extensión puede ser teñida inmediatamente después de rociarla, con lo que se acorta el tiempo total del proceso. El secado al aire sin fijar se emplea cuando se van a realizar ciertas tinciones como por ejemplo la de May Crundwald Giemnsa, con esta tinción no se ve bien la cromatinanuclear y se usa en citologías hematológicas.
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